适于SSR分析的茶树高质量基因组DNA提取方法

对野生型、过渡型和栽培种茶树分子遗传多样性研究中遇到的DNA提取问题进行了试验,针对茶树组织内富含多酚、多糖、色素及次生代谢物质的特点,以茶树嫩叶为试材,采用改良CTAB法获得了高质量的茶树基因组DNA。运用本方法提取的茶树总DNA作为模板用多条EST-SSR引物和自身开发的基因组SSR引物进行PCR扩增并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带,结果表明,改良后的方法适用于不同类型的茶树叶片DNA提取,所得DNA带型完整,质量较高,扩增SSR产物条带清晰,证实所提DNA适用于后续的SSR分析。     

番茄叶片DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了进一步开发利用番茄种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用高通量组织研磨机研磨微量叶片,通过改良CTAB法快速提取DNA,并利用L16(45)正交设计试验,综合采用直观量化分析和方差分析两种方法,分析Mg2+、d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA浓度5个因素对番茄SSR-PCR扩增的影响,比较不同处理组合扩增效果的差异,最终筛选与验证最优的番茄SSR-PCR反应体系,并在此体系下对SSR引物进行筛选。结果表明番茄SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为Mg2+3.0 mmol/L、d NTPs 0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、引物0.5μmol/L、模板DNA 40 ng;且利用优化后的反应体系,从540对SSR引物中筛选出373对(占69.07%)扩增条带清晰、多态性丰富的引物。该SSR-PCR体系的建立为番茄种质资源遗传多样性分析,品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

云南岩白菜资源的DNA提取和ISSR引物筛选

提取滇产岩白菜资源的基因组DNA并进行ISSR引物的筛选,为用ISSR标记研究云南岩白菜资源的遗传多样性奠定基础。DNA提取采用改良的CTAB法,质量检测采用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法,ISSR引物选用加拿大哥伦比亚大学开发的100条引物。结果表明,从18份云南岩白菜资源的幼叶中提取了基因组DNA,浓度在1 387.5～12 000 ng/μL之间,A260/A280的值在1.61～1.85之间,琼脂糖凝胶电泳检测呈一条带;从100种ISSR引物中筛选出了22种扩增结果好的引物。所提DNA质量较高,该提取方法适用于从酚类和蛋白质含量高的植物材料中提取DNA;22个ISSR引物可用于岩白菜资源的遗传多样性研究。     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L_(16)(4~5)正交试验设计。通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg~(2+)、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、Mg~(2+)和模板DNA浓度分别为1 U/20μL、0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.25 mmol/L和75 ng/20μL。扩增实验结果表明,该反应体系稳定性较好,可重复性高,具有较好的分辨率。可从59对引物中筛选出14对适用于元宝枫并具有较明显的多态性的SSR引物,为进一步研究元宝枫的分子标记辅助育种、SSR遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了良好的基础。     

大豆SSR技术反应体系的优化

以大豆为材料,研究了PCR反应体系的主要成分模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶浓度及退火温度对大豆SSR扩增结果的影响,探索影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量及引物的退火温度。结果表明:在试验设计范围内,DNA浓度和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在0.05~0.2μmol/L范围内对扩增影响较小,Taq酶浓度对扩增有一定影响,引物要有其扩增适宜的退火温度。确立了适合大豆SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μL,模板DNA 20 ng,dNTP 200μmol/L,引物0.15μmol/L,Taq酶0.5 U,10×Taq Buffer 1.5 mmol/L,ddH2O补至20μL。     

月季SSR-PCR反应体系的建立和优化

采用L16(54)正交设计和二因素完全随机试验,分析了月季SSR-PCR反应体系的主要成分Taq DNA聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对扩增结果的影响,建立了适合月季的SSR反应体系.研究结果表明:在20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶宜加入1.5U,样本最适宜浓度为30～40 ng,Mg2+的最适浓度为1～1.5 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为1μmol/L.用建成的反应体系对19对引物筛选,对12个月季品种扩增,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,证明该体系稳定可靠.     

海南油茶SCoT反应体系建立与多态性引物筛选

SCoT-PCR是一种单引物扩增分子标记。为了将SCoT分子标记应用于海南油茶的分子鉴定和遗传多样性评价中,本研究采用单因素试验和正交试验结合方法,分析模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物4种因素对海南油茶SCoT-PCR扩增结果的影响,构建海南油茶SCoT-PCR体系,并筛选多态性引物。单因素试验结果表明：DNA浓度对海南油茶扩增效率影响不大,高浓度dNTPs利于扩增产物,而Taq酶和引物扩增高效率偏于中浓度。正交试验结果表明：各因素对海南油茶SCoT-PCR扩增影响大小依次为引物>Taq DNA聚合酶>dNTPs>模板DNA;总体系为20μL时,最佳反应体系中模板DNA用量为30 ng,dNTPs浓度为0.30 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.00 U。利用构建的SCoT-pcr体系对80条SCoT单引物进行筛选,最终筛选出16条SCoT条带清晰的多态性引物,多态性比率平均值达到76.25%。本试验结果可为海南油茶的遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究提供参考数据。     

药用菊花SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为进一步开发利用药用菊花种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用L25(56)正交设计对影响药用菊花SSR-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物等5个因素进行优化,并对SSR引物进行筛选。结果建立了药用菊花SSR-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng,正、反向引物0.25μmol/L,d NTPs 0.3 mmol/L,Mg2+3.0 mmol/L,Taq酶1.5 U。运用优化后的反应体系,从136对引物中成功筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物57对,大多数条带大小集中在100~500 bp,不同引物扩增的条带数为5~15条。优化的SSR-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,获得了稳定性、重复性良好和多态性丰富的扩增图谱。该体系的建立可为今后利用SSR标记对药用菊花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

枫香ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为探索最适的枫香叶片DNA提取方法、最优ISSR引物和最佳ISSR-PCR扩增反应体系,本试验采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法、高盐低pH法和试剂盒法提取枫香叶片DNA;采用三因素五水平(DNA模板用量,2×Taq Master Mix用量引物浓度)正交试验构建并优化枫香的ISSR-PCR反应体系;对100条ISSR引物进行筛选及其退火温度优化。结果表明：改良CTAB方法提取的DNA浓度高,且电泳条带清晰无污染;SDS和试剂盒方法提取DNA的浓度低,电泳条带亮度低;高盐低pH值法提取的DNA的电泳条带模糊且降解拖尾现象严重。DNA模板浓度为20 ng、Taq Master Mix用量为10μL、引物浓度为0.6μmol/L、ddH₂O为7.8μL时扩增程序的条带最清晰、多态性最好。筛选出17条重复性强、条带清晰明亮、多态性高的ISSR引物及其最适退火温度,其中扩增位点数最多的为引物UBC-834、UBC-836和UBC-853,扩增位点均为13个,以UBC-878为ISSR引物时的扩增反应中,当退火温度在46.9℃的时候能够扩...     

利用PCR仪快速提取甜菜基因组DNA

为了寻找一种快速提取甜菜基因组DNA的方法,以甜菜干种子、幼苗、种仁以及甜菜叶片干粉为原料,利用PCR仪结合碱裂解法快速提取甜菜基因组DNA,利用微量分光光度计检测取DNA的浓度,并用甜菜SSR引物对提取的DNA进行扩增。结果表明,在4 种材料中均检测到了DNA,干种子、幼苗、种仁以及叶片干粉中提取的DNA平均浓度分别为432、197、158、448 ng/μL,无论是DNA原液还是稀释到20 ng/μL的工作液,均能在SSR-PCR反应中扩增出清晰的条带。该方法提取甜菜基因组DNA简单、快速,仅需要NaOH和HCl两种药品,提取的DNA完全可以用于SSR-PCR反应,为快速鉴定甜菜品种纯度和真实性提供了技术支持。     

苦荞全基因组SSR位点特征分析与分子标记开发

目前苦荞SSR多态性标记数量较少,根据已发表的苦荞基因组测序数据,利用MISA软件对1~6核苷酸重复的SSR位点进行了查找和序列特征分析,批量设计引物并对引物进行了有效性和多态性检测。结果表明,苦荞基因组中共检测到1 640个SSR位点,其中三核苷酸重复型SSR最多,占比63.29%,五核苷酸重复型最少,仅占0.12%。AT/TA、AAG/CTT、ACC/GGT和ATC/GAT为出现频率较高的重复基序。苦荞基因组SSR序列长度变化范围为12~476bp,平均长度23.14bp,长度12~19bp的占比71.71%,长度≥20bp的占比28.29%。根据不同类型SSR位点设计并合成引物479对,选择200对引物对5份苦荞资源和3份甜荞资源进行多态性检测,有56对扩增出多态性条带,17对在苦荞种质中产生多态性条带,48对在甜荞种质中产生多态性条带,9对同时在两种种质中产生多态性条带。利用苦荞全基因组序列可实现SSR标记的批量开发,可鉴定出适用于苦荞和甜荞遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等研究的SSR引物。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

苦瓜基因组DNA的提取及ISSR扩增体系的优化

为了快速获取高质量的苦瓜基因组DNA,以便进行苦瓜白粉病抗性基因分子标记研究,比较了不同的DNA提取方法、不同部位的苦瓜叶片提取基因组DNA的产量和质量,探究了苦瓜基因组DNA提取的最佳方法和叶片的最适部位;研究了ISSR-PCR的退火温度,并采用正交设计法对影响ISSR-PCR的Mg²⁺、dNTPs、Taq酶、模板DNA以及引物浓度等5个因素进行了优化。结果表明,采用改良CTAB法从苦瓜顶端嫩叶中提取的基因组DNA OD260/OD280值在1.8~1.9之间,OD260/OD230值为2.0左右,对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,主带清晰,降解较少,产量和纯度均较高,效果较好。优化后的ISSR-PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl₂,250μmol/L dNTPs,10 ng模板DNA,0.75 U Taq酶,引物浓度0.7μmol/L,反应总体积为25μL,引物UBC826最佳退火温度为53℃。该体系在多次重复中均能获得良好的扩增结果。苦瓜基因组DNA提取的最佳方法为改良CTAB法,最适合的部位为顶端嫩叶。     

荞麦属(Fagopyrum Mill)植物资源的RAPD研究

以10个随机引物对荞麦属(Fagopyrum)11个种(含大粒组7个种,小粒组4个种)共50份栽培及野生荞麦资源进行RAPD研究.初步建立了养麦属不同物种的RAPD指纹图谱.系统聚类分析表明,荞麦属大粒组和小粒组组间以及不同荞麦种间在DNA水平上差异极大.在大粒组中苦荞DNA与其他种之间有较大的差异.大野荞和毛野荞分别与甜荞和苦荞在RAPD水平上较近缘,支持它们分别是甜荞和苦荞祖先种的假说.     

3个苦荞品种对盐胁迫的生理响应及耐受性评价

为研究不同苦荞品种对盐胁迫的生理响应及耐受性,以3个苦荞品种野鸡苦荞、宁苦2号和湖南苦荞7-2为材料,采用盆栽试验,分别用0、50、100、150mmol/L NaCl溶液处理,通过观察和测定幼苗叶片形态特征、幼苗生长指标和生理生化指标,采用隶属函数分析法对不同苦荞品种耐盐性进行综合评价。结果显示,在盐胁迫下3个苦荞品种叶片出现失水皱缩和黄化腐烂的症状,以高浓度伤害最明显;随NaCl浓度的升高,3个苦荞品种的鲜重、干重、株高、茎粗和根长均表现出下降趋势;叶绿素、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性呈先上升后下降趋势,以100mmol/L处理最高,过氧化物酶活性和相对电导率呈上升趋势,以150mmol/L处理最高;根系活力呈下降趋势,以150mmol/L处理最低。经过隶属函数分析及综合评价,3个苦荞品种耐盐性表现为宁苦2号>湖南苦荞7-2>野鸡苦荞。     

芝麻SRAP反应体系的建立与优化

以芝麻幼叶提取的DNA为试验材料,通过对影响SRAP扩增结果的重要反应因素dNTPs、Mg2 + 、Taq酶、随机引物及模板DNA进行优化,建立了芝麻扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的SRAP最佳反应体系：dNTPs（10mmol／L）0.30μl,Mg2 +（25mmol／L）1.20μl,Taq酶1.00U,正反引物各50ng,DNA模板80ng,10×Buffer 1.5μl,总体积15μl,为SRAP标记技术在芝麻分子生物学研究方面的应用奠定了基础。     

玉米种子DNA快速提取及杂交种纯度的快速鉴定

本研究用玉米杂交种渝单8号及其双亲的干种子作为材料,使用NaOH溶液研磨玉米种子胚,提取基因组DNA,并利用多重PCR扩增进行玉米杂交种子的纯度鉴定.结果表明,利用玉米种子快速提取方法获得的DNA可进行正常的SSR扩增,并且从20对玉米核心引物中筛选出了8对扩增谱带呈双亲互补型的引物,将其中3对引物YISSR、phi072和phi299852组合起来扩增,扩增谱带清晰可辨,对渝单8号杂交种子的纯度进行准确鉴定.初步表明利用多重PCR技术鉴定玉米种子纯度是可行的,不仅简便快速,而且降低了检测成本.     

番薯藤中硝酸盐 亚硝酸盐和VC含量的测定

对番薯藤不同可食部位(叶片、叶柄、嫩茎)以及漂烫处理后,番薯藤叶的硝酸盐、亚硝酸盐含量进行测定,参考蔬菜中硝酸盐含量分级评价标准和我国制定的无公害蔬菜亚硝酸盐含量限量标准进行评价。结果表明,作为蔬菜的番薯藤,其嫩叶(顶端叶)叶片的硝酸盐含量低于轻度污染水平444mg/kg,亚硝酸盐含量低于我国制定的无公害蔬菜亚硝酸盐含量的限量标准,VC含量高于50mg/100g,属于一级野菜,可以安全食用;番薯藤成熟叶(中部叶)和老叶的叶片、嫩茎、嫩叶的叶柄的硝酸盐含量高于807mg/kg而低于1268mg/kg,亚硝酸盐含量低于我国制定的无公害蔬菜亚硝酸盐含量的限量标准,属于三级蔬菜,不可生食和盐渍食用,可熟食;番薯藤成熟叶叶柄的硝酸盐含量高于1268mg/kg,属于硝酸盐重度污染水平,属于四级蔬菜,不宜食用。     

芝麻SSR检测体系的优化与应用

为了建立一套适用于芝麻SSR标记检测的技术体系,以5个芝麻新品种为试验材料,选用35对SSR引物,从反应体系、反应程序、电泳、银染4个环节进行优化。结果表明：反应总体积为10 μL,优化后的基本成分及用量分别为25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL,10 mmol/L dNTPs 0.3 μL,5 U/μL Taq酶0.3 μL,50 ng/μL Primer 0.9 μL,10×Buffer 0.7 μL,25 ng/μL DNA模板2.5 μL,ddH2O 4.1 μL。反应程序为：94℃ 3 min;94℃ 1 min,60℃ 30 s,72℃ 45 s,10个循环;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 45 s,30个循环;72℃ 5 min。PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银快速染色检测效果良好。筛选出多态性较强的SSR引物24对,用这些引物对20个品种进行扩增,初步分析了SSR标记应用于芝麻DNA指纹分析的潜力。