冠突散囊菌研究进展

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯砖茶“发花”过程中的优势菌,在特定的温、湿度条件下,其可在茯砖茶中形成黄色闭囊壳,俗称“金花”,是表征茯砖茶品质的重要指标之一。文章从冠突散囊菌的鉴定命名、生理特性、功能及其对茯砖茶品质的影响与应用方面进行了综述,并对目前存在的问题及未来的发展方向进行了讨论与展望。     

不同产区加工的茯砖茶中“金花”菌的分离及分子鉴定

为探明不同地域茯砖茶中"金花"菌的异同,采用陕西、湖南和浙江3个产区同等级的黑毛茶为原料,分别在本地及其他2个产区同一时期加工成9个茯砖茶样,运用纯培养技术,观察茶样中"金花"菌在不同培养基上的形态特征,同时结合现代分子生物学技术,对茶样中的"金花"菌进行了鉴定。结果表明:从9个茯砖茶样品中,分离获得了13株"金花"菌,在不同培养基中的形态学特征与散囊菌属的特征非常相近,且菌株G9、G10的形态特征与其他"金花"菌明显不同;通过对特异性区段ITS和β–tubulin序列扩增、测序,经同源序列搜索比对及构建的系统发育树进一步分析,并参照Hubka最新的曲霉属分类系统,最终将不同地域(陕、湘、浙)加工的茯砖茶中的优势菌鉴定为冠突曲霉,异名冠突散囊菌;浙江产区加工的茯砖茶中分离获得的非优势"金花"菌G9和G10鉴定为谢瓦曲霉。     

不同原料及生长因子对冠突散囊菌固体培养特性的影响

[目的]为茯砖茶的开发利用提供参考。[方法]对茯砖茶发花过程中的优势菌—冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的特征、生长条件、对营养成分的利用及发花过程中茯砖茶主要成分变化的研究进行了综述。[结果]大部分冠突散囊菌菌株在CZG、PDA培养基上生长速度较快,其生长适温为25~35℃,最适生长pH值为5。有机氮对菌落生长具有较好的促进作用,无机态氮、酰胺态氮、氨态氮有利于孢子荫发;有关碳源对菌落生长的影响研究结果不一致。冠突散囊菌可提高茯砖茶的含氮量,减少其可可碱和茶碱的含量,增加脱镁叶绿酸酯a、b及叶黄素、β-胡萝卜素的含量。[结论]有关冠突散囊菌的生理特性、功能特性及其与茯砖茶品质形成的关系等方面的研究有待进一步深入。     

“湘益”牌茯砖茶真菌的分离及鉴定研究

采用平板梯度稀释法对金湘益特制礼品茯砖茶中真菌进行了分离纯化和计数,获得2301、2401、3302、4304、5402等5种类型真菌,其中5402为优势菌,每克茶样中含量达4.98×106个,其余为非优势菌,数目相对较少。运用18S rDNA片段序列进行同源比对,结合形态学鉴定方法对其进行鉴定,表明菌株2301为产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、2401为产黄青霉(P.chrysogenum)、3302为青霉(Peni-cillium sp.)、4304为酱油曲霉(Aspergillus sojae)、5402为蜡叶散囊菌(Eurotium herbariorum)。     

用DGGE法初步解析茯砖茶渥堆发酵过程中真菌群落的结构

为研究茯砖茶发花过程中真菌群落的结构和种类,对茯砖茶渥堆发酵过程中不同时间段黑毛茶样品中真菌群落的18S rDNA高变区进行扩增,对真菌18S rDNA变性梯度凝胶电脉(DGGE)图谱中的条带进行回收、克隆、测序和序列比对。结果表明:茯砖茶渥堆发酵过程中的真菌类型丰富,有好干性酵母(Wallemia sebi)、假丝酵母菌(Candida sp.)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、路德酵母(Lodderomyces sp.)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、隐球酵母(Cryptococcus sp.)、牧草红酵母(Rhodotorula graminis)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、白地霉(Galactomyces geotrichum)、安大略假单胞菌(Candida ontarioensis)、真皮毛孢子菌(Trichosporon dermatis)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、曲霉(Aspergillus penicillioides)等真菌存在;以渥堆24 h为分界点,真菌群落结构在分界点前后变化较大;真菌群落多样性指数在渥堆0~16 h呈升高趋势,16~24 h略有降低,24 h后继续升高,在渥堆后40 h上升到最高水平2.348,而渥堆40~48 h仍然维持在较高水平;在整个渥堆过程中,优势菌路德酵母、汉逊德巴利酵母和次优势菌阿姆斯特丹散囊菌均有出现,在渥堆后期出现了次优势菌好干性酵母、汉逊德巴利酵母和酿酒酵母;比对结果表明,渥堆过程中同时存在3株好干性酵母菌和7株阿姆斯特丹散囊菌,说明在渥堆发酵过程中优势菌种存在多样性。本研究结果表明,采用DGGE指纹图谱能全面、真实地反映茯砖茶渥堆发酵过程中真菌群落的结构和多样性变化。     

冠突散囊菌液体培养条件的正交优化

[目的]研究冠突散囊菌(Eurotium cristatum)液体培养条件.[方法]采用L16(45)正交试验设计,对影响冠突散囊菌生长的主要因素,包括黑茶浓度、蔗糖浓度、pH、培养温度和接种量进行5因素4水平筛选分析.[结果]冠突散囊菌最优的液体培养条件为:黑茶浓度为0.7％,蔗糖浓度为5％,pH为5,培养温度为29℃,接种量为1％(孢子浓度为6.0×108cfu/ml).[结论]该研究可为现代发酵工程技术应用于茯砖茶生产提供科学依据.     

泾阳茯茶生产环境中冠突散囊菌多样性检测

为阐明陕西省泾阳县茯茶生产环境中冠突散囊菌是否为同一克隆系,分别从泾阳县2个代表不同生产方式的茯茶厂的不同生产工段采集原料茶叶、茯茶半成品及成品、生产环境涂抹拭子、空气沉降样和土壤等样品,采用平板划线和涂布法分离得到26株疑似冠突散囊菌,并对其进行分类鉴定。结果表明:基于菌落形态特征鉴定后,初步确定26株菌为"冠突散囊菌"。对26株"冠突散囊菌"26SrDNA D1/D2区及其内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer;ITS)序列进行PCR扩增、序列测定并提交基因库比对,使用Mega 6.0软件构建进化树分析鉴定后,确认得到的菌株均为冠突散囊菌,且菌株的26SrDNA D1/D2区及ITS序列均具有高度的同源性。研究初步阐明存在于陕西省泾阳县茯茶生产环境的冠突散囊菌相似度极高,为同一克隆系。     

茯砖茶中冠突散囊菌的分离鉴定及富硒菌株筛选

对陕西茯砖茶中冠突散囊菌进行分离与鉴定,并筛选出具有较强富硒能力的菌株。从8种陕西茯砖茶中分离出54株纯化菌株,通过形态学观察及ITS基因序列分析鉴定得到32株冠突散囊菌。经硒胁迫培养从中筛选出8株耐硒能力强的冠突散囊菌,并确定其生长最适硒质量浓度为30μg/mL。进一步的富硒培养结果表明,菌株SXFCD.8在此硒浓度下的富硒能力最强,其生物量为(28.92±0.94)mg/100mL,富硒量为(628.38±20.96)μg/g。最后利用LC-ICP/MS对菌株SXFCD.8的硒形态进行分析,共检测到6种硒形态,其中4种与标准物质相匹配,包括SeMet、SeCys2、MeSeCys和Se(IV)。硒形态分析表明冠突散囊菌具有较强的有机硒转化和富集能力。     

六堡茶中金花菌的分离与鉴定

[目的]研究鉴定六堡茶中的金花菌,为推动六堡茶产业发展提供一定的理论基础.[方法]采用平板涂布法及三点接种法从梧州中茶茶厂2015年11月生产的六堡茶中分离纯化金花菌,以传统的形态学观察法观察菌落特征,利用光学显微镜观察菌丝、分生孢子等结构特征,再结合分子生物学方法对分离获得的菌株进行DNA序列分析,并通过ITS序列进行同源性搜索比对和系统发育进化树分析.[结果]分离获得一株金花菌,命名为LB-1.LB-1菌株的形态特征与散囊菌属很相似,主要表现为:菌落呈金黄色、 有同心环、 有放射性脊等,其ITS序列与阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)的同源性达99%,进一步确定LB-1菌株为阿姆斯特丹散囊菌.[结论]从六堡茶中分离获得的金花菌LB-1为散囊菌属中的阿姆斯特丹散囊菌.在六堡茶加工中,可为LB-1菌提供适宜的环境,促进其大量繁殖,以增强六堡茶的保健功效.     

茶叶中23株真菌的分离鉴定

我国茶叶特别是发酵茶叶中含有许多有益真菌,其代谢产物具有抗菌、抗癌、降脂、降压的功能。目前,关于茶叶中真菌功能的研究很多,但在畜牧业中尚无相关应用研究。取湖南安化金花茯砖茶、天福南糯山熟饼、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁门红茶和金茯茶共8种茶叶进行真菌分离、纯化,共得到23株菌株,通过形态学和ITS基因序列的鉴定,共得到拟茎点霉菌1株,变色栓菌1株,枝状枝孢菌1株,黑曲霉2株,曲霉菌1株,冠突曲霉2株,阿姆斯特丹曲霉6株,棕曲霉2株,格孢菌1株,扩展青霉菌1株,拟盘多毛孢菌1株,球孢枝孢菌2株,变色曲霉2株。结果为这些真菌的进一步研究和在生产实践中的应用提供了物质基础。并且将其中的优势菌属冠突散囊菌进行扩大培养,为后期的生产实践做好准备。     

HPLC法测定不同年份下关沱茶咖啡因的含量

[目的]用HPLC法比较不同年份下关沱茶咖啡因的含量。[方法]水煮法提取不同年份下关沱茶中的咖啡因,提取液离心后,采用C18柱分离,HPLC—UV检测。以甲醇溶液为流动相A,0．4％磷酸的水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为1．0ml／min,检测波长为274nm,柱温为25℃,进样量10μl。[结果]咖啡因在0．218～2．180μg范围内线性关系良好,回归方程Y=315．779X＋25．956,r为0．9999。咖啡因的平均回收率为101．3％,RSD为0．36％,5年的沱茶中咖啡因含量测定值分别为19．307、20．114、20．270、19．739、19．733mg／g,其平均值为19．832mg／g,RSD为1．90％。[结论]研究结果表明,沱茶中咖啡因的含量随生长时间的变化不大。     

都匀毛尖茶挥发性成分及其抑菌活性测定

【目的】比较不同生长阶段鲜叶和不同等级成品都匀毛尖茶挥发性成分的差异,并研究其抑菌活性.【方法】用同时蒸馏萃取法分别从3种都匀毛尖茶鲜叶和4种成品茶中提取挥发性成分,用气质联用仪进行测定,结合Nist2005和Wiley275谱库鉴定各成分,用峰面积归一化法测定各成分的相对含量.用琼脂平板打孔法将7个样品的挥发油对6种常见菌株进行抗菌试验.【结果】7个样品共检出124种挥发性化学成分,相同成分18种.3种鲜叶茶共检出73种挥发性成分,相同成分40种.4种成品茶共检出93种挥发性成分,相同成分35种.7个样品对枯草芽孢杆菌均有抑制作用.除一芽一叶初展外,其余6个样品对金黄色葡萄球菌均有抑制作用.【结论】加工对都匀毛尖茶的挥发性成分有一定影响,不同生长阶段、不同等级茶的挥发性成分也有差异.都匀毛尖茶挥发性成分具有一定的抑菌活性.     

茶园叶面真菌与茶云纹叶枯病原菌的互作关系研究

[目的]探索茶园叶面分离的真菌与茶云纹叶枯病原菌的相互作用关系。[方法]通过平板对峙培养方法进行真菌和茶云纹叶枯病原菌培养,对比研究从生态茶园和非生态茶园叶面分离的真菌与茶云纹叶枯病原菌的相互作用。[结果]根据叶面真菌对病原菌的作用．将病原菌分为桔抗菌、共生菌和协生菌3类。两类茶园中这3类菌的构成比例无明显差异,非生态茶园中这3类菌分别为72．9％、5．1％和22．0％,而生态茶园中为72．5％、4．4％和22．1％。非生态茶园中弱拮抗作用的菌株为优势菌株,比生态茶园高9．8％,而有强拮抗作用的菌株的比例非生态茶园比生态茶园中低7．4％。两类茶园中对病原菌有明显促进作用的菌株构成也不相同,生态茶园中为6．8％,而非生态茶园中为5．9％。[结论1该研究为茶园病害的生物防治提供了理论依据。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的药敏试验

[目的]为研制有效防治鲤鱼细菌性败血症的疫苗提供依据。[方法]从河北省某渔场具有典型细菌性败血症症状的鲤鱼中分离出2株优势菌,对分离菌进行生化鉴定、16S rRNA基因序列测定,并研究分离菌的药物敏感性。[结果]根据2株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),发现2株分离菌均为气单胞菌属的嗜水气单胞菌,认为嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的病原菌。分离到的2株嗜水气单胞菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、加替沙星等15种抗生素均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出了菌株差异。[结论]对嗜水气单胞菌敏感的15种抗生素可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物。     

紫花苜蓿根腐病生防菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

【目的】筛选获得对紫花苜蓿根腐病病原菌具有拮抗作用的菌株,并对其发酵条件进行优化,为紫花苜蓿根腐病生物防治提供菌株资源。【方法】以青藏高原的紫花苜蓿根际土壤为研究对象,以紫花苜蓿根腐病5种病原菌为靶标,利用稀释涂布法分离细菌;利用平板对峙法筛选对苜蓿根腐病病原菌具有拮抗作用的菌株;利用平板对峙法和菌丝生长速率法测定拮抗菌株对5种苜蓿根腐病病原菌的抑菌活性;通过形态学观察、生理生化测定和16S r DNA序列分析确定拮抗菌株的分类地位;利用单因素试验和正交试验对拮抗菌株发酵条件进行优化。【结果】从紫花苜蓿根际土壤中共分离纯化出92株细菌,从中筛选出16株对供试病原菌具有较强拮抗作用的菌株,其中菌株LJ3-1的抑菌效果最强,且具有广谱抑菌活性。对菌株LJ3-1发酵滤液的抑菌活性测定结果显示,其发酵滤液对供试病原菌的抑制率为44.9%～77.4%。结合菌落形态特征、生理生化测定和16S rDNA序列分析结果,将菌株LJ3-1鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。对菌株LJ3-1的发酵条件优化结果显示,其最适发酵培养基组分为3%葡萄糖、1%酵母浸粉和0.5%NaCl;最适发...     

不同年份青砖茶改善小鼠胃肠道功能的研究

以昆明小鼠为对象,研究不同剂量、不同年份湖北青砖茶对小鼠胃排空、小肠推动和肠道菌群作用。理化检测发现,2010年青砖茶氨基酸、茶黄素、茶红素、茶褐素、咖啡碱、有机酸含量显著高于2016年与2006年,儿茶素总量与可溶性糖含量显著低于2016年与2006年。连续给予小鼠青砖茶不同剂量提取物15d后,发现中剂量(1 667mg/kg)改善小鼠肠胃功能的效果最佳,为最有效剂量。高剂量(3 334 mg/kg)减缓胃排空,低剂量(834mg/kg)显著增加双歧杆菌数量,抑制肠球菌数量。另外,与正常组比较,3个年份湖北青砖茶均能有效促进胃排空和肠蠕动,并优化肠道菌群,2006年青砖茶的效果最为显著,主要表现为小肠推进率最高,肠杆菌、肠球菌数量最低,乳酸菌、双歧杆菌数量最高。     

不同嫩度茶树鲜叶对金花散茶理化品质的影响

以不同嫩度的夏秋茶树鲜叶为原料,人工接种发酵金花散茶,分析了在14 d的发酵过程中,不同嫩度鲜叶发酵的金花散茶理化成分的动态变化。结果表明,在发酵过程中,不同嫩度鲜叶发酵的金花散茶茶褐素含量呈增加趋势,其他内含成分含量总体呈下降趋势,整体以嫩度高的鲜叶发酵的金花散茶内含成分含量更高。综合考虑,以一芽三四叶鲜叶人工接种发酵10 d,更有利于金花散茶的品质形成。