IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株的快速鉴别诊断

【目的】利用限制性酶切位点的特异性,鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株。【方法】根据IBDVVP2基因的共保守序列设计1对引物,分别以IBDV超强毒株GX8/99、陕西分离株、强毒株(XZ-1、ZZ-1、JL、GX-2、JS-2、SD-1、SD-3、HeN-4、ZJ-1、JX-2、JS-30)和疫苗株(B87、NF8)的VP2保守序列为模板,采用RT-PCR方法扩增VP2基因的共保守序列,并构建IBDV不同毒株的重组质粒。用AhaⅠ/StuⅠ和BamHⅠ/NspⅠ2组限制性内切酶分别对超强毒株、强毒株及疫苗株的重组质粒进行酶切鉴定。【结果】扩增出了IBDVVP2基因中的共保守序列,其长度为802 bp。超强毒株能被AhaⅠ/StuⅠ切出327 bp的片段,而强毒株及疫苗株则能被BamHⅠ/NspⅠ切出270 bp的片段。【结论】此种RT-PCR结合限制性内切酶酶切的鉴别方法能够很好的区分IBDV超强毒株与强毒株和疫苗株。     

IBDV荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其应用

研究根据传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因序列设计了两条引物,通过RT-PCR技术对IBDV的VP2进行扩增,构建IBDV-VP2的标准品质粒,建立基于IBDV-VP2基因的荧光定量RT-PCR检测(QRT-PCR)技术和标准曲线,并检测该QRT-PCR体系的特异性、灵敏度和重复性,最后将该QRT-PCR体系应用于鸡外周血淋巴细胞(PBLs)中IBDV超强毒株(vvIBDV)复制规律以及临床样品的检测.结果表明,建立的QRT-PCR体系特异性好,不能与NDV、IBV及FAV1等发生反应,敏感度为1.51×101拷贝数/μl,扩增效率达1.018,重复性试验组内变异系数和组间变异系数均小于0.5％;在vvIBDV感染后6h收获的细胞含病毒基因组拷贝数最高,对IBD疑似病例的检测敏感度高于套式RT-PCR技术.表明建立的反应体系特异、灵敏度高,并具有很好的稳定性,可应用于病毒复制水平的检测和临床样品的检测.     

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.     

鸡传染性法氏囊病诊断

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的禽的一种淋巴组织坏死为特征的急性、接触性传染病.目前IBD在世界范围内呈广泛流行.近几年来在新疆地区时有流行,波及乌鲁木齐、昌吉、玛纳斯、克拉玛依、库尔勒、吐鲁番等地.1992年春,阿拉尔垦区某鸡场的小鸡突然大批发病,经临床症状、病理学、细菌学、病毒学等检查确诊为鸡传染性法氏囊病.1 发病情况及临床症状发病鸡大多在1月龄,个别鸡群1个半月龄.垦区13团某鸡场养殖40日龄鸡1100多只.发病300多只,发病率27%,死亡110只,死亡率10%,病鸡羽毛杂乱、蓬松、口渴、眼闭或半闭、战粟、脱水、眼窝凹陷,采食减少,精神萎顿.下痢,排水样稀粪.     

应用ELISA间接法检测抗IBDV单克隆抗体

本文用 ELISA 间接法,研究并建立了抗鸡传染性法氏囊病毒单克隆抗体的检测体系。实验证明,该法具有简便、灵敏、迅速、特异性强、准确性高及重复性好的优点。是研究筛选抗 IBDV单抗杂交瘤细胞的可靠方法。     

IBDV超强毒株和弱毒株VP2基因同义密码子使用偏爱性研究

应用RT-PCR方法扩增并克隆了分离自河南省的30株IBDV超强毒和9株弱毒株VP2基因cDNA序列,研究IBDV超强毒和弱毒株的VP2高变区基因不同位点同义密码子的使用情况。结果表明,超强毒株和弱毒株除特定位点的特征性氨基酸不同外,在同义密码子的使用上也有明显的偏爱性。这预示着同义密码子的使用与VP2基因表达及其表达产物的空间结构有关,进而可能影响到IBDV的毒力。     

中药粗提物对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染细胞能力的影响

将黄芪、连翘等八味中药的粗提物与鸡传染性法氏囊病病毒以三种顺序 (先加中药后加病毒、先加病毒后加中药、中药和病毒同时加入 )加入至培养 2 4 h、已长成完整单层的鸡胚成纤维细胞 (CEF)上 ,观察其对病毒感染细胞能力的影响。结果表明 ,在细胞安全浓度范围内 ,仅黄芪粗提物在先于病毒或与病毒同时加入时抑制 IB-DV病毒感染 ,且抑制作用与浓度和加药方式有关     

一例鸡传染性法氏囊病病毒强毒株的分离与鉴定

采用鸡胚接种法从江苏省海安县某发病鸡群中分离出一株病毒,通过琼脂扩散试验等确定该病毒为传染性法氏囊病病毒.将该分离毒株接种到4周龄健康鸡后第2天即开始发病,第3～5天出现死亡高峰,死亡率达80％.免疫保护性试验结果表明,用该毒株制成的灭活苗对鸡的保护力达100％.     

生物素标记IBDV─RNA探针的制备及其对IBDV─RNA检测的初步研究

以传染性法氏囊病毒强毒株接种９日龄鸡胚尿囊腔，待鸡胚死亡后，收集其尿囊液，提取病毒。纯化的病毒ＲＮＡ在３％琼脂糖凝胶电泳上呈现出２９０ｂｐ和３４００ｂｐ的两条带。收集这两条带，以病毒全基因组制备生物素标记的探针。此探针有良好的特异性。它不与其它３种禽类病毒（ＮＤＶ，ＩＢＶ，ＩＬＶ）的核酸抽提物发生交叉反应。此试验是快速、敏感、可重复的。其敏感度达０．５ｐｇ。     

传染性法氏囊病毒安徽超强毒株的分离及分子鉴定

应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种﹑琼脂扩散试验、电镜观察,从临床病鸡的法氏囊组织分别分离到3株传染性法氏囊病病毒(IBDV)CH03、JG04和QJ04株,对4周龄未免疫鸡的攻毒致死率分别为92%、83%、67%,对鸡胚的半数致死量(ELD50)分别为10-6.8/0.2ml、10-5.4/0.2ml、10-4.6/0.2ml;应用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的IBDVVP2基因高变区(vVP2)及其序列分析的结果表明,序列共有492个核苷酸,编码164个氨基酸。关键位点的氨基酸变化特征:第一亲水区P222A、疏水区的K249Q和S254G、N279D和T284A,与超强毒参考株UK661﹑HK46﹑OKYM和CH1-97极为相似,而与致弱株Cu-1)及变异毒株Var-E存在明显差异。研究结果表明,获得的3株IBDV分离株均属超强毒株。     

SYBR GreenI模式荧光RT-PCR鉴别新城疫病毒毒力

 【方法】根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green I模式的荧光RT-PCR方法比较两对引物对同一NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值，来区分NDV的毒力。【结果】对8株NDV进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。     

应用反转录-多聚酶链式反应检测鸡IBDV的方法研究

通过对鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）RNA的提取、反转录及PCR反应条件、检测灵敏度等进行探讨,结果表明,采用反转录-多聚酶链式反应（RT－PCR）是检测鸡传染性法氏囊病病毒的可靠方法,RNA的提取简单易行,不经过病毒提纯,可检出的病毒RNA最低量可达1pg。     

一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组测序及其分子特征

[目的]测定一株鸡传染性法氏囊病病毒基因组序列及其分子特征。[方法]分离出一株具有特殊分子特征的鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）超强毒株（vvIBDV）HLJ-0504,并对其基因组进行了克隆和测序。[结果]序列分析显示,HLJ-0504的基因组A节段属于超强毒株,而其B节段则来源于另外一个独特的祖先。动物实验表明,HLJ-0504对SPF雏鸡的致病率和致死率分别为100%和86.7%。[结论]具有独特基因组B节段的vvIBDV仍在我国流行,我国IBDV的进化特征存在多样性。IBDV的毒力不是由基因组的A或B单独决定的。     

传染性法氏囊新城疫病毒二联疫苗株接种后气管黏膜损伤研究

为了研究传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒（rlasota—vo2）二联疫苗株的免疫机制,用rlasota—vp2免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在接种后的1,3,5,10,15,18d取气管,进行光镜、电镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布;光镜观察发现,接种后第3d黏膜下层水肿,淋巴细胞、巨噬细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层有数层不成熟的细胞组成;接种后第10d,腺体腔闭塞。免疫组化染色（IHC）气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。电镜观察发现接种rlasota—vp2后第3d纤毛细胞有脱纤毛现象。接种第3d杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露到表面;接种后第10d,可以看到纤毛细胞纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18d,纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。这说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。     

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。     

鸡传染性法氏囊病病毒dsRNA的提纯与应用

用传染性法氏囊病病毒（IBDV）攻击4周龄的非免疫鸡，以超速离心法从感染鸡法氏囊组织中分离、纯化IBDV，应用蛋白酶K消化和Trizol（异硫氰酸胍－酚－氯仿法）处理2种方法从纯化的IBDV中抽提dsRNA。通过低熔点琼脂糖割胶－酚－氯仿抽提可获得纯化的dsRNA，研究发现应用蛋白酶K消化获得的纯化RNA产量高，用其作模板进行RT－PCR可扩增IBDV基因组全长cDNA A片段和B片段、VP2基因和VP2－4－3基因。     

Pathogenic Antigenic and Molecular Characterization of the Very Virulent Strain(Gx) of Infectious Bursal Disease Virus Isolated in China

The very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) strain Gx was isolated from a poutl-try farm in Guangxi Province, China, during 1996. The mortality in the infected flock was 80% and occurred5 days after immunization with serotype I IBD vaccine. The results of antigen-capture ELISA (AC-ELISA),pathogenicity testing, cloning and sequence analysis of the VP2 gene showed that the deduced amino acid se-quence of strain Gx VP2 was the same as vvIBDV UK661, which is considered as a reference strain for Europe-an vvIBDVs. The antigenicity of the Gx strain was the same as an European vvIBDV strain 849. The EID50 of Gx virus was 10-8. 25/0. 2 ml, and the mortality was 64 % when 4 week-old SPF chickens were challenged atdosage of 2 × 103 EID50. We have demonstrated that the IBDV strain Gx isolated in China is vvlBDV according to European standards.     

传染性法氏囊病病毒的PCR引物设计与Internet检索分析

研究了传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片断的ｃＤＮＡ的结构,并使用ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ引物设计软件,在ＶＰ５和ＶＰ２的重叠基因区设计了一对引物,各种ＩＢＤＶ毒株在此部位有非常高的同源性,在对引物进行Ｉｎｔｅｒｎｅｔ检索中得到了证实。经过对４种ＩＢＤＶ的疫苗标准毒株,１种野毒株,１例病鸡标本试检测,验证引物设计符合要求,具有良好的适应性和较高的灵敏度。