应用RT—PCR技术快速检测马铃薯纺锤块茎类病毒

根据马铃薯纺锤块茎类病毒序列,设计合成了一对特异性引物．以感染PSTVd的马铃薯试管苗为材料,提取其总RNA,获得纯度较高、完整性较好的总RNA．以此总RNA为模板,进行cDNA合成及PCR扩增,从感病组织中扩增得到一段约为359bp的特异RNA扩增产物,与理论设计大小一致,而健康组织无此扩增产物．     

PSTVd，PLRV和PVS在马铃薯试管苗不同部位继代积累规律研究

 为研究病毒和类病毒在马铃薯试管苗不同部位的积累规律,利用实时荧光定量PCR和DAS-ELISA两种方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)和马铃薯S病毒（Potato virus S, PVS）在马铃薯试管苗基部和顶端继代培养5代（继5代）后的含量。结果表明：PSTVd,PLRV和PVS在马铃薯试管苗常规组织培养过程中是逐代传递的,其在马铃薯试管苗顶端和基部的积累规律存在显著的品种差异,分别供试的7个品系中,存在PSTVd顶端积累和基部积累效应的各3个品系,存在PLRV顶端积累和基部积累效应的分别为4个和2个品系,存在PVS顶端积累和基部积累效应的分别为3个和2个品系,其中PSTVd的顶端积累效应最强为基部的4倍;同一马铃薯品系的顶端和基部对不同病毒和类病毒的积累趋势相对一致。实时荧光定量PCR是一种灵敏度很高的定量检测马铃薯病毒和类病毒的方法。     

福建省马铃薯纺锤块茎类病毒快速检测及序列分析

为检测福建省马铃薯纺锤块茎类病毒及了解其分子变异情况,以感染马铃薯纺锤块茎类病毒的植株为试验材料,提取RNA,反转录cDNA,利用设计合成的特异性引物进行RT-PCR检测,扩增产物经回收纯化后克隆和测序。结果表明,PCR扩增出359bp的特异片段,将扩增产物经回收和纯化并进行克隆与测序,测序结果经BLAST比对后,该片段为PSTVd基因序列,PSTVd分离物命名为Fujian PTSTd(KM588065.1),与国内外报道的PSTVd分离物同源性达98%以上。该分离物与弱毒株系(M14814.1)、中间株系(AY492084.1)和强毒株系(U23058.1)比对,有11个核苷酸具有多态性,其中5个发生在致病区。不同国家和地区序列进化树分析表明,该分离物与我国北方及欧美国家分离物亲缘关系最近,与新西兰分离物亲缘关系最远。     

榆林地区马铃薯纺锤块茎类病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕西省榆林地区种植2~3代的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成一对特异引物,反转录合成cDNA,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后回收纯化扩增产物并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。电泳结果表明,在榆林地区的马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,说明这些马铃薯均感染了PSTVd;序列分析表明,10个不同采样点PSTVd的目的片段大小为250~251 bp,只是单个碱基之间的转换或缺失,PSTVd在榆林地区几乎没有发生变异,与国内外其他15个地区已报道的序列一致性在82.3%~99.5%之间。     

马铃薯纺锤块茎类病毒云南分离物的序列分析

【目的】了解云南省马铃薯纺锤块茎类病毒分子变异情况及其致病机制。【方法】以采自云南2个不同地方疑似马铃薯纺锤块茎类病毒病的块茎为材料,对其提取总RNA、反转录为c DNA,利用特异性引物进行RT-PCR检测,扩增产物经纯化后克隆并测序。【结果】扩增产物全长357 bp,分别命名为PSTVd-DasongpingYN(KX159281)和PSTVd-Lianghe YN(KX159282)。将这2个分离物与国内外已报道的PSTVd株系全序列构建系统发育树,并与已报道的PSTVd弱毒、中毒和强毒株系进行序列比对和二级结构预测,表明PSTVd-Dasongping YN和PSTVd-Lianghe YN与PSTVd弱毒株系更接近。【结论】PSTVd-Dasongping YN和PSTVd-Lianghe YN的序列相似性为97.5%,存在9个碱基差异,且主要集中在可变区(V)和右末端区(TR),说明云南不同地方分离物PSTVd也存在差异。PSTVd-Dasongping YN和PSTVd-Lianghe YN属于PSTVd的弱毒株系组。     

乌鲁木齐地区马铃薯纺锤块茎类病毒的检测与序列分析

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成1对引物,对新疆乌鲁木齐地区马铃薯田间感病植株进行一步法RT-PCR检测,扩增出251 bp大小的目标片段,而健康植株无此扩增产物。将目的片段克隆到pGM-T载体上并进行序列测定,构建系统进化树分析各分离物间的分子差异性。结果表明马铃薯纺锤块茎类病毒乌鲁木齐分离物与国内外已报道毒株的核酸序列同源性达93.6%~99.2%。     

彩色马铃薯茎尖培养及病毒检测技术

为了探明彩色马铃薯茎尖培养方法,获得彩色马铃薯无毒试管苗,研究了不同质量浓度植物生长调节剂组合的培养基对21份彩色马铃薯后代品系组培苗形成的影响,并用RT-PCR方法对试管苗进行马铃薯主要病毒检测。结果表明,筛选出的组合(MS+NAA0.05mg·L~(-1)+6-BA0.1mg·L~(-1)+GA30.2mg·L~(-1)+泛酸钙0.2mg·L~(-1))可作为闽薯1号茎尖诱导分化的最佳培养基,优化的植物生长调节剂组合在不同的彩色品种茎尖分化和植株形成差异较大,试管苗经RT-PCR检测6种马铃薯病毒(PVX、PVY、PVS、PVA、PVM和PSTVd),获得了11份彩色马铃薯脱毒苗,可用于大田生产用试管苗。     

马铃薯纺锤块茎类病毒山西分离物侵染性克隆的构建

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。     

NASH技术和R-PAGE技术在马铃薯类病毒检测上的应用

往复聚丙烯酰胺凝胶电泳 (R- PAGE)和核酸斑点杂交技术 (NASH)是检测马铃薯块茎类病毒(PSTVd)的主要技术 ,利用这两种方法 ,进行马铃薯脱毒试管苗的类病毒检测。结果表明 ,两种方法得到了相似的检测结果。通过试验 ,比较两种检测方法在检测灵敏度、操作性、检测量等方面的优缺点和可行性。NASH方法具有较高的灵敏性 ,适合大批量样品检测和异地取样。而 R- PAGE可区分类病毒的强弱系 ,对试验条件和技术条件要求低于 NASH方法     

费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗的培养基筛选与病毒的RT-PCR检测

以分别携带3种病毒(PVX、PVY、PLRV)和纺锤块茎类病毒(PSTVd)的费乌瑞它(Favorita)马铃薯(Solanum tuberosum)无菌苗为材料,38℃、4h热处理4周,剥离带1个叶原基的茎尖,接种至不同浓度激素组合的24种MS固体培养基上,24℃、16h培养15d后统计茎尖的愈伤组织诱导率和分化成苗率;反转录PCR(RT-PCR)检测茎尖分化再生苗的脱毒率.结果表明,最适宜费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗的培养基为MS+0.075 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA +0.10 mg/L GA3,愈伤组织诱导率为75％,分化成苗率为47.5％;再生苗3种病毒PVX、PVY和HRV的脱毒率分别为65％、90％和100％,纺锤块茎类病毒PSTVd的脱毒率为10％.     

马铃薯试管苗病毒检测技术研究

根据大兴安岭马铃薯种薯生产实际,应用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测茎尖组织培养试管苗的带毒情况,鉴定危害马铃薯生产的6种主要病毒(PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV),并结合指示植物如千日红进行最后鉴定,筛选健康、无毒的试管苗,为切段扩繁及试管薯生产作准备。该方法简单易操作,可作为国内生产脱毒种薯单位的标准检测方法进行推广。     

我国在防治马铃薯类病毒病中存在的问题及防治对策

马铃薯纺锤块茎类病毒病(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是威胁我国马铃薯生产的重要病害之一,已经给我国的马铃薯生产造成了严重影响,导致了经济损失.在防治该病害方面存在着脱除难,检测不到位,脱毒种薯质量控制体系不健全,监管力度不够等问题.今后,要加大PSTVd脱毒技术的研究,选用健康的...     

冬种马铃薯卷叶病田间调查及RT-PCR检测技术研究

对惠州市冬种马铃薯卷叶病发病情况进行调查研究,建立了马铃薯卷叶病毒(PLRV)RT-PCR检测技术。结果表明,马铃薯卷叶病发病率为3.0%～29.7%。比较LiCl、异硫氰酸胍和试剂盒3种方法提取马铃薯卷叶病毒总RNA,以异硫氰酸胍和试剂盒提取效果较好,LiCl次之;根据卷叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,从感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,合成cDNA并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约336bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康叶片RNA扩增未得到任何产物。应用RT-PCR技术对马铃薯试管苗和种薯进行了卷叶病毒检测。     

培育健壮马铃薯试管苗试验

我们在马铃薯茎尖锐毒和试管苗繁殖过程中发现，马铃薯试管苗生长细弱，茎叶嫩黄与带有高效浓度的马铃薯纺锤块茎类病毒及几种主要马铃薯病毒有关。用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法和酶联夹心法检测筛选出无病毒的试管苗作为试材，排除类病毒和病毒侵染的干扰，以提高培养基中营养元素含量作为培育健壮试管苗的措施。试验结果表明，２倍ＭＳ液体培养处理的试管苗生长茁壮，浓绿，加速了干物质累积，使继代培养周期３－４周缩短为２－３周     

马铃薯脱毒试管苗组培快繁及脱毒种苗的生产技术

通过热处理马铃薯块茎，使茎尖剥离并经病毒检测获得脱毒苗，经脱毒试管苗的快速繁殖，选择生长健壮的试管苗作扩繁材料；在温网室采用无土栽培法在严格隔离条件下生产微型薯（原原种），再生产一、二级原种及一级良种（生产种）。生产中应注意种薯的分级、种薯田的田间管理和收获贮藏、包装运输等过程。本体系将脱毒种薯生产时间缩短为4年，减少了病毒感染的机会，提高了脱毒种薯的质量。     

不同种类培养基对马铃薯茎尖生育影响

凉山州西昌农科所自1990年开展脱毒马铃薯微型种薯规模化生产以来，试管苗生产已取得较好的成绩。在试管苗生产中，为获得出苗快、且出苗率高的脱毒试管苗，本所开展了不同种类培养基对马铃薯茎尖生育影响的试验，为生产上提供质优、高效、成本低的试管苗生产方法。     

不同组分及低磷钾胁迫的马铃薯试管苗快繁培养基研究

为培养出高品质、高效率、低成本的马铃薯脱毒试管苗,以马铃薯脱毒试管苗克新13为试验材料,以MS为基础培养基,研究不同组分的快繁培养基对马铃薯试管苗农艺性状、生物量及叶绿素含量的影响。结果表明:不添加有机物的培养基,可保证试管苗健康生长;不添加微量元素和铁盐的培养基不利于试管苗的生长。不添加有机物且大量元素中添加磷、钾素减半的低磷、钾胁迫的培养基没有对试管苗的生长产生不利影响,多数指标与在CK培养基上生长的试管苗水平较接近,而且在活叶数、有效茎节数、生物量、平均根长以及平均根条数方面优于全量添加的CK培养基。从节约成本的角度考虑,不添加有机物且大量元素中磷素和钾素减半的MS培养基可以应用于马铃薯试管苗的生产中。     

3种商品化Trizol试剂提取高质量马铃薯块茎总RNA的比较

针对马铃薯块茎含有多糖多酚的特点,选用3种快捷的商品化提取试剂提取马铃薯块茎总RNA.结果表明:3种商品化试剂均可不同程度的提取马铃薯块茎总RNA,提取的总RNA的28S、18S和5SrRNA条带清晰可见,但纯度和浓度存在较大差异;其中用Trizol裂解加柱吸附法提取的马铃薯块茎总RNA纯度较高,但浓度较低,经SMART PCR和LD-PCR检测可扩增出马铃薯块茎腺苷葡萄糖磷酸化酶小亚基(sAGP)基因和全长双链cDNA,可用于后续分子生物学试验.     

马铃薯茎尖剥离与试管苗培养技术

在无菌环境下对马铃薯茎尖进行剥离，并分步接种到特定的培养基上，在25℃±2℃的温度、10001x～40001x的光照条件下培养，并经病毒鉴定后可生产出健康的马铃薯脱毒试管苗。对试管苗进一步切段繁殖，可生产大量的脱毒苗。     

往复双向电泳法(R-PAGE)检测马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)核酸制备的改进

双向往返电泳(R-PAGE)法是检测马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的有效手段，本试验通过对该方法中马铃薯纺锤块茎类病毒核酸提取步骤的改进，提高了核酸纯度，使检测结果更为准确、清晰，且灵敏度高。