玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5'' RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白,分子量为27.78 kD, 等电点(pI)为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调,推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。     

GmCHS8和GmIFS2基因共同决定大豆中异黄酮的积累

大豆异黄酮受多基因控制,采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。我们之前的研究中表明,CHS8基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用,但CHS8基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用Microarray技术,检测了高异黄酮品种RCAT Angra (RCAT)和低异黄酮品种Harovinton (HVNT)的18 362基因在种子发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势,利用RT-PCR证实CHS8和IFS2分别是CHSs和IFSs基因家族中的主要基因;证实CHS8是类苯基丙醇主路径中的主基因,并发现异黄酮支路中的IFS2基因在RCAT和HVNT品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统,在大豆上分别过量表达CHS8、IFS2和CHS8+IFS2,前两者异黄酮含量较对照分别提高65.9%和34.4%,但增幅未达显著水平;而后者则提高了82.3%,增幅达显著水平(P<0.0001),因而证实大豆中异黄酮的积累由CHS8和IFS2基因共同决定。     

大豆GmCOL4基因的克隆与分析

CONSTANS(CO)是植物光周期开花途径中的关键基因之一。通过RT-PCR和生物信息学的方法,克隆了大豆GmCOL4基因并分析其结构特征,用实时荧光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)研究了其转录特点。结果表明,GmCOL4的4个外显子编码一个具有B-box和CCT保守结构域的CO-like蛋白,在序列上与拟南芥(Arabidopsis thaliana)COL9相似性最高,为64.3%。分析其转录特征发现,GmCOL4表达主要受生物节律的影响,受光的调节作用较弱。器官特异性表达分析发现,GmCOL4主要在大豆叶片中表达,表达模式与COL9相似。这为大豆中CO基因家族的功能研究提供了重要的依据。     

白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用,利用这些基因改良作物抗逆性具有重要意义。本研究在白菜中分离到一个DREB类转录因子基因BpDREB1 (EF219470)。该基因序列全长647 bp,推测编码蛋白含213个氨基酸,相对分子量为23 kD,理论等电点为5.11,与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明,BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示,BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后,其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子基因具有家族成员基因结构的特征,在低温、干旱应答途径中起重要作用。     

大豆GmNF-YC2基因的克隆与功能分析

NF-Y (nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物, 是由3个不同的亚基(A, B, C)组成, 并通过作用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。本文从大豆KN18中克隆大豆NF-YC基因GmNF-YC2, 并且利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其表达模式, 发现GmNF-YC2的表达受光调控, 并在开花期第3复叶中表达量最高。结果表明, GmNF-YC2在大豆光周期开花调节中起重要作用。拟南芥原生质体瞬时表达实验证实, GmNF-YC2蛋白定位在细胞核中。这为大豆NF-YC家族基因的功能研究提供重要依据。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

花生种子休眠解除过程中相关基因的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状,外源乙烯利能诱导花生种子休眠的解除,为了阐明乙烯利作用下花生种子休眠解除的分子机制,设置吸胀的休眠种子为对照,100 mg L–1乙烯利处理吸胀休眠种子后不同时间的样品(AE1、AE2、AE3)进行转录组分析,比较了花生种子休眠解除过程中ABA、GA、ETH、auxin相关基因的表达。结果表明,15个与GA、40个与ABA、60个与ETH、56个与auxin相关的unigenes在花生种子休眠解除过程中表现显著差异表达。荧光定量PCR结果显示,ABA合成关键基因Ah NCED2和代谢关键基因Ah CYP707A1在种子休眠解除过程中均受外源乙烯利诱导,表达差异显著;在休眠和无休眠种子吸胀萌发过程中,Ah NCED2和Ah CYP707A1的表达趋势不同,Ah NCED2对于种子休眠的维持发挥积极作用,而Ah CYP707A1对于种子休眠解除发挥积极作用。     

野生大豆转录因子GsNAC20基因的分离及胁迫耐性分析

NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子作为一类新型转录因子已成为非生物胁迫基因工程领域的研究热点。本研究以野生大豆(Glycine soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与MYB1AT元件(核心序列为AAACCA)结合的转录因子基因,该基因与大豆NAC20 (EU440353.1)基因具有99%的相似性,命名为GsNAC20。GsNAC20蛋白含有典型的NAC结构域和转录激活区。酵母试验表明,GsNAC20转录因子能够与耐逆相关顺式元件MYB1AT特异结合,但不具有自激活功能。细胞定位分析证明该基因位于细胞核中,符合转录因子的特征。GsNAC20能够响应高盐、干旱和低温胁迫,并且在根和叶中具有不同的表达模式。超量表达GsNAC20基因的拟南芥对盐胁迫的敏感性提高。以上结果表明GsNAC20参与植物非生物胁迫反应过程,该基因在非生物胁迫基因工程研究领域具有良好的理论研究和实际应用价值。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟中及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN),获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种5 d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式(1~4个)整合至大豆基因组中。对T1~T3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T2和T3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显著提高,病情指数降低至4.37%~18.51%,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显著提高转基因大豆对SMV的抗性水平。     

大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和lh时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因...     

大豆立枯丝核菌G蛋白ß亚基基因的克隆与分析

由立枯丝核菌[Rhizoctonia solani Kühn,有性世代：Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk] 引起的大豆纹枯病(Soybean sharp eyespot)是一种重要病害。G蛋白β亚基(Guanine nucleotide binding protein beta-subunit)作为重要的信号传导因子,在植物病原菌致病分子机制中起着重要作用。为了解G蛋白β亚基基因的结构与功能,根据同源物种G蛋白β亚基相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术克隆了大豆立枯丝核菌G蛋白β亚基的基因序列和开放阅读框(G-protein beta-subunit of Soybean Rhizoctonia solani,简写为gbsrs1,GenBank登录号为EU663628)。该片段全长1 864 bp,含有4个内含子和5个外显子;开放阅读框(ORF)长1 047 bp,编码348氨基酸残基,与多种真菌G蛋白β亚基的氨基酸序列相似程度较高,达79.72%~99.43%;该蛋白质具有2个α-螺旋和7个β-折叠的二级结构,形成无规则卷曲连接的桶形三级结构。将gbsrs1的ORF连接于原核融合表达载体pGEX-4T-2中,经IPTG诱导,获得了相应蛋白的表达。gbsrs1的克隆和特性研究为了解大豆立枯丝核菌的致病机理、有效防治纹枯病奠定了基础。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

铝胁迫下大豆根尖细胞铝的微区分布与耐铝性分析

以浙春3号为实验材料, 利用透射电镜(TEM: Transmission Electron Microscope)-X-射线能谱(EDS: Energy Dispersive X-ray), 调查铝胁迫下大豆根尖铝的微区分布及耐铝性。结果表明,Al³⁺胁迫导致根尖细胞细胞壁不规则加厚, 线粒体数量增多, 核膜膨胀, 液泡中存在较多的电子致密沉淀物。90 mg L^-1 Al³⁺处理的根尖细胞内含物完全降解消失, 仅剩细胞壁。10 mg L^-1 Al³⁺处理的线粒体、细胞壁和液泡电子致密沉淀物中均检测到Al;随着Al³⁺处理浓度的增大, 各细胞器中Al的质量和原子数百分比逐渐增大。线粒体在60 和90 mg L^-1Al³⁺处理下, 液泡电子致密沉淀物在90 mg L^-1Al³⁺处理下,均未被检测出Al。在60 mg L^-1Al³⁺处理下唯一一次在细胞核中检测到Al。Al³⁺抑制了根系生长, 根系细胞中细胞壁的Al³⁺含量受影响最明显。P/Al在细胞壁和线粒体中的相对原子数随Al³⁺浓度的增大而下降。研究结果表明X–射线能谱对铝在亚显微结构上的定位是一种快速、有效的方法。铝最先积累在细胞壁上, 随Al³⁺处理浓度增大逐渐积累于部分细胞器和细胞核中, 且含量在细胞中的分布亦由外向里呈递减趁势。     

BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性

类萌发素蛋白(germin-like protein, GLP)是一类含有cupins结构域的糖蛋白, 在植物基础抗性等方面起着重要作用。本研究人工合成了甜菜GLP基因BvGLP1, 并利用基因重组技术构建了受韧皮部特异表达启动子RSS1P驱动的BvGLP1基因单子叶植物表达载体pA20-RSS1P::BvGLP1。通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中, 对转基因扬麦18的T₀至T₃代植株中BvGLP1进行了PCR、半定量RT-PCR和荧光定量QPCR检测, 并对转基因小麦进行根腐病和纹枯病抗性鉴定。结果表明, BvGLP1已转入转基因小麦扬麦18, 并能在转基因小麦中遗传、转录表达; 5个转BvGLP1基因小麦株系的根腐病抗性比受体品种扬麦18有显著提高, 说明BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性。     

MADS-box基因GmAGL15在大豆种子发育过程中的表达

以同源序列法克隆了大豆MADS-box基因GmAGL15, 序列分析表明, 该基因编码的氨基酸与拟南芥AGL15蛋白的同源性为61%, 其中在MADS区的同源性为84.3%, K区的同源性为63.2%。半定量RT-PCR分析表明, GmAGL15在幼胚中高度表达, 而没有检测到在根、茎、叶和花中的表达。荧光定量RT-PCR分析发现, GmAGL15在大豆种子发育的不同时期均有不同程度的表达, 其中在开花后15 d的幼胚中表达量较高, 而在开花后30 d的幼胚中表达量最高。以上结果显示, 基因GmAGL15对于大豆种子发育的调控可能有重要作用。     

WO3/g-C3N4复合催化剂的制备及其可见光 光催化性能分析

在盐酸质子化条件下,采用超声微波协助法成功制备了可见光型复合催化剂WO₃/g-C₃N₄。利用X射线多晶粉末衍射仪(XRD)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、紫外可见漫反射(UV-Vis)和BET比表面测试仪对样品进行了表征,并以罗丹明B(RhB)为目标降解物对其光催化性能进行研究。结果表明:复合催化剂样品是由片状的WO₃纳米片负载在g-C₃N₄表面组成的。当WO₃负载的质量分数为40%时,前驱物在500℃条件下煅烧2 h后所得样品的光催化性能明显好于同条件下制得的单一相WO₃和g-C₃N₄,在可见光(波长大于420 nm)照射下,5 h内对100 mL浓度为10^-5 mol/L罗丹明B橙溶液的降解高达98%。     

郑麦9023春化基因VRN-1的组成及表达

以郑麦9023叶片为材料,利用序列特异性PCR扩增技术克隆了春化基因VRN-1,并通过0~2℃冰箱模拟春化处理0、10、20和30 d,对该基因在一叶期至九叶期叶片中的表达进行了分析。PCR分析表明,VRN-1基因在郑麦9023的A和D基因组中均为隐性,在B基因组中为显性,基因等位类型为vrnA1VrnB1vrnD1。在克隆VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1基因序列的基础上,设计了3个等位基因的特异引物,并利用该特异引物进行半定量RT-PCR分析。结果显示,在未经春化处理的条件下,一叶期VRN-A1和VRN-D1均未检测到表达,而VRN-B1已有较低水平的表达;从三叶期开始,3个等位基因都有较高水平的表达,并一直持续至开花期。在春化处理10、20和30 d条件下,VRN-1的3个等位基因在一叶期就出现较高水平的表达,并保持至开花期。     

津田芜菁BrSIZ1基因克隆、定位及表达

SIZ1是植物细胞蛋白质翻译后修饰SUMO化的E3连接酶,参与植物蛋白相互作用、定位和抗逆反应等。为研究BrSIZ1在津田芜菁中的表达特性,本研究克隆了津田芜菁SIZ1基因全长cDNA序列,命名为BrSIZ1 (GenBank登录号为KY441465),该基因全长2754 bp,其ORF全长2571 bp,编码856个氨基酸残基的多肽。构建了BrSIZ1-GFP表达载体进行亚细胞定位研究,结果显示BrSIZ1-GFP定位于细胞核内,可能在细胞核中发挥其功能。利用荧光定量PCR检测表明,该基因表达量在叶子中最高,幼苗和红色根皮中次之,表达具有组织特异性。而且BrSIZ1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导,在4°C、37°C胁迫的幼苗中,表达量增加。