TaqMan探针荧光PCR检测副猪嗜血杆菌方法的建立和应用

为了建立基于TaqMan探针荧光PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法,本试验参考GenBank已发表的副猪嗜血杆菌(Hemophilus parasuis,HPS)转录起始因子infB基因序列,利用生物学软件Primer Express 2.0设计特异性引物和探针;并对副猪嗜血杆菌标准菌株提取DNA后进行PCR扩增,将产物测序鉴定后克隆到pMD1s-T载体,再转化到大肠杆菌感受态细胞,细菌培养后对菌液进行PCR扩增,把产物测序鉴定后获得的重组质粒作为标准阳性对照;最后将建立的TaqMan探针荧光PCR方法进行灵敏度、特异性、稳定性试验.结果显示,该检测方法可以达到1μl1.0×101拷贝数量级的灵敏度;另外,该方法可以将HPS和大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开,特异性良好;稳定性试验显示,2次批内变异系数分别为0.65％和0.92％,批间变异系数为1.31％,稳定性良好.对口岸送检的56份猪肉和12份血浆蛋白粉样品进行检测,结果表明TaqMan探针荧光PCR方法和细菌分离方法的检测效果一致.     

华南地区副猪嗜血杆菌的耐药性特点及四环素耐药基因携带情况

 【目的】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是危害世界养猪业的重要细菌性病原菌之一,了解副猪嗜血杆菌临床分离株的耐药性特点和四环素耐药基因的携带情况,为临床上该病的防控提供科学依据。【方法】参考CLSI推荐的肉汤微量稀释法检测副猪嗜血杆菌华南分离株对21种抗菌药物的耐药性,用PCR方法检测9 种四环素耐药基因的携带情况,并利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型技术对携带四环素耐药基因的菌株进行了遗传相关性分析。【结果】结果显示：被检菌株对磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类抗菌药物表现较强的耐药性,尤其对磺胺类药物的耐药率高于80%;对头孢菌素类药物比较敏感;菌株都耐受3种或3种以上的抗菌药物,其中以7重和8重耐药菌株的数量最多,分别占19.13%和17.39%。2008-2010年华南地区副猪嗜血杆菌的耐药性总体上呈现逐年上升的趋势。15.62%（18/115）的菌株携带tetB基因,这些菌株之间表现明显的遗传差异性,但是部分菌株存在克隆传播关系。【结论】副猪嗜血杆菌对抗菌药物的耐药性比较高,tetB基因在耐四环素的副猪嗜血杆菌中广泛存在,表明主动外排泵作用可能是副猪嗜血杆菌对四环素产生耐药性的主要机制。本研究有助于了解副猪嗜血杆菌耐药性的变化特点,并初步揭示了该菌对四环素的耐药机理。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

针对副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)16 S rRNA序列设计1对特异性引物,能扩增出821 bp的特异性DNA片段,并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性.13份疑似病料检测结果表明,PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100％.结果表明已成功建立了副猪嗜血杆菌PCR检测方法,并可应用于临床副猪嗜血杆菌的检测.     

副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用

从养猪场送检的猪肺病料中分离到3株疑似副猪嗜血杆菌(HPS)可疑菌株。经形态镜检、染色特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPS。在细菌学鉴定基础上,设计合成3对引物,分别以3株分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp8、24 bp和1.9 kb的预期特异性条带。以HPS GD株作为参考阳性菌株,以P1、P2为引物,设计优化PCR反应程序,建立HPS PCR检测方法,并应用于临床病料检测。结果表明,所建立的HPS PCR检测方法特异与敏感性高、适用性强,可应用于HPS感染的诊断和检测。     

副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用

[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。     

复合PCR鉴定巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的方法

在已经建立的多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了PM、HIS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增多杀性巴氏杆菌的457 bp和副猪嗜血杆菌的1 090 bp的特异性片段.检测灵敏度分别达7.2 Pg DNA/1 040 CFU和16.0 Pg DNA/2 300CFU,用所建方法检测临床分离的23株可疑菌株和本实验室人工感染猪分离菌,结果显示,23株可疑株有2株检出多杀性巴氏杆菌特异性条带,没有检出副猪嗜血杆菌特异性条带;人工感染分离菌株均扩增出副猪嗜血杆菌特异性条带.表明该方法能够对临床上这2种疾病进行鉴别诊断.     

多重PCR检测副猪嗜血杆菌毒力相关三聚自转运蛋白

为建立快速检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)毒力相关三聚自转运蛋白(Trimeric autotransporters,Vta A)的多重PCR方法,根据HPS Vta A Vta A1和Vta A3基因为模板,设计合成了2对特异性引物,进行多重PCR扩增及反应条件的优化,并对多重PCR扩增的敏感性和特异性进行了分析.结果表明:所建立的多重PCR检测方法对HPS Vta A1和Vta A3基因分别能扩增出406和291 bp的目的条带,最小检测限为3.4×107cfu/m     

副猪嗜血杆菌hhdA基因的鉴定和分析

副猪嗜血杆菌可引起猪的格氏病,其不同毒力菌株分子水平上的差异还不清楚.从广东省不同地区猪场送检病猪中分离到9株细菌(H1～H9),并对其16SrRNA基因进行鉴定和分析.经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定,所分离的9株细菌为阳性副猪嗜血杆菌,具有卫星现象和不溶血特征.用hhdA基因引物从分离菌株中扩增到了特异性片段,...     

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用

在已经建立的胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了APP、HPS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增APP的442 bp,和HIS的1090 bp的特异性片段,并应用于临床检测.该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义.     

副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与临床诊断结果基本一致。【结论】建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法能够对副猪嗜血杆菌病做出较为快速、准确的诊断;陕西省存在副猪嗜血杆菌不同程度的感染,规模猪场集中饲养的猪感染副猪嗜血杆菌的比率明显高于散户。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

采用超声裂解副猪嗜血杆菌分离株5型菌体上清作为包被抗原,初步建立副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。通过棋盘滴定法筛选确定最佳反应条件:抗原包被浓度50mg/L,37℃作用2h后4℃过夜包被,血清的稀释度为1∶320,抗原抗体反应时间为50min,酶标二抗稀释度为1∶12 000,作用时间为30min,底物显色时间为15min。经特异性、敏感性和符合性试验检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌上海株的分离鉴定及耐药特性的研究

从送检的病猪内脏中分离到4株副猪嗜血杆菌疑似菌株,经过培养菌落及镜检形态观察、V因子依耐性试验及卫星生长现象、溶血性检查、生化特性以及特异的PCR检测,对其做了准确的鉴定,均为副猪嗜血杆菌。将4株分离株PCR扩增产物进行测序分析并与GenBank中报道的部分副猪嗜血杆菌的同源性达到97.3%~100%。药敏试验结果表明分离菌株已对新生霉素、阿米卡星、林可霉素、红霉素和庆大霉素等抗生素产生了较强的耐药性,仅阿奇霉素、头孢拉定、菌必治、先锋必、氧氟沙星和呋喃妥因等药物抑菌效果较好。     

副猪嗜血杆菌病的防治方法

猪的上呼吸道上经常寄生着一种病菌就是副猪嗜血杆菌,这种病菌是一种条件性致病菌,各种应激因素都容易引发此种病菌,它在自然环境中大量存在.基于此,文章主要对副猪嗜血杆菌病的防治方法进行了探讨.     

副猪嗜血杆菌病的诊治

副猪嗜血杆菌病是一种由副猪嗜血杆菌引起猪的接触性传染病,又称纤维性浆膜炎和关节炎.副猪嗜血杆菌病的发病率每年呈明显的上升趋势,对猪场造成严重的经济损失.本文介绍了一例保育猪副猪嗜血杆菌病的发病情况、临床剖检、实验室诊断、治疗与防控,以期为副猪嗜血杆菌病的临床诊断与防治提供参考.     

副猪嗜血杆菌耐药性调查和耐药机制

副猪嗜血杆菌病的发生严重危害养猪业的发展,大量抗菌药物的使用使副猪嗜血杆菌的耐药性不断增强。为了更好地防控副猪嗜血杆菌病,本文围绕副猪嗜血杆菌耐药性和耐药机制进行研究,以供广大读者借鉴参考。     

副猪嗜血杆菌病的防治

副猪嗜血杆菌病,也作猪副嗜血杆菌病。副猪嗜血杆菌病曾一度被认为是由应激所引起的。     

猪副猪嗜血杆菌病的诊治

副猪嗜血杆菌是引起猪多发性浆膜炎和关节炎的病原体,近几年来,该病已成为影响养猪生产的一种重要疫病。介绍了猪副猪嗜血杆菌病的临床症状、剖检病变、诊断与防治方法,并对如何防控猪副猪嗜血杆菌病提出了建议。     

猪副猪嗜血杆菌病的防治

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种常在条件性致病菌,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征,严重危害了仔猪和青年猪的健康。采取严格环境控制、加强饲养管理、选用敏感药物和疫苗防治相结合的综合防控措施,可有效控制该病。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与血清学检测试验

在病史调查、临床症状、特征性病变观察、病料采集、细菌分离培养、生化鉴定的基础上,抽取贵州地区猪场发病猪群血样进行间接血凝试验检测。结果表明:贵州地区部分猪场存在副猪嗜血杆菌的感染,且感染率随着猪日龄的增长而降低,猪场平均感染幅度在10%~33%。