番茄中WRKY2基因的克隆

WRKY转录因子在植物应对生物或非生物胁迫的反应及生长和发育中起重要作用,为研究WRKY转录因子在番茄中的功能,本研究根据课题组已经克隆的番茄WRKY转录因子片段设计引物,采用RT-PCR方法,从JA诱导的番茄幼苗中,获得了608 bp的cDNA片段。序列分析表明,该序列含有WRKYGQK保守结构域,与Capsicum annuum WRKY-c序列相似性是79%,与Nicotiana tabacum NtWRKY-7序列相似性是74%,表明已经成功克隆了番茄WRKY2基因片段。     

茄子SmWRKY1转录因子基因克隆及序列分析

克隆茄子转录因子SmWRKY1基因,对其序列进行分析,为SmWRKY1基因在茄子抗逆分子育种的应用中提供理论依据。以茄子幼苗为试材,依据GenBank上已提交的番茄、甜椒、烟草的WRKY基因序列设计引物,提取总RNA利用RT-PCR方法扩增得到基因片段,克隆、测序并通过NCBI在线和DNAMAN等软件对其核酸及氨基酸序列进行分析。同源克隆得到SmWRKY1,核酸序列930 bp,翻译为310个氨基酸组成的蛋白序列,其中Ser和Thr量最多,分别占总氨基酸数的12.0%和11.0%。NCBI检索SmWRKY1属于WRKY基因超家族,第114至120个氨基酸含有WRKY保守结构域“WRKYGQK”,其锌指结构为C2H2型,初步证实SmWRKY1属于第二大类WRKY转录因子。DNAMAN构建茄子SmWRKY1与不同植物WRKY蛋白的系统发育树,表明茄子WRKY1与番茄中的WRKY1蛋白亲缘关系最近,同源性达96%。WRKY基因在植物耐逆性的研究中有着重要的作用,通过克隆出SmWRKY1基因片段,为进一步克隆其全长、研究其功能做前期准备,为分子育种、培育茄子耐逆性新品种奠定了一定的基础。     

白菜型油菜WRKY基因片段的克隆与表达分析

WRKY转录因子能广泛地参与植物的生物与非生物胁迫反应。为了研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控,首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段, 用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术（real-time relative quantification PCR,以下简称RT-qPCR）检测WRKY基因在ABA(100 μM)诱导不同时段的差异表达。在白菜型油菜中克隆到一段中克隆到一段长度为680 bp的WRKY基因片段和一段长度为933 bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1 h后表达量最高。本实验文成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

海岛棉GbWRKY40基因的克隆及特征分析

【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定量聚合酶链式反应分析其表达模式,通过构建酵母表达载体并转化酵母菌株AH109研究其转录激活活性。【结果】该基因c DNA全长1713 bp,5'非编码区长261 bp,3'非编码区长510 bp;开放阅读框长942 bp,编码313个氨基酸,预测相对分子质量约为34.138×103,等电点为8.46,包含5个外显子和4个内含子;其编码蛋白含有1个WRKY保守区(WRKYGQK)和1个锌指基序(C-X5-C-X23-H-X1-H),属于WRKY家族第Ⅱ类a组,包含3个核定位信号区,与陆地棉GhWRKY40同源性最高。GbWRKY40在根和开花后25 d纤维中表达量高,而且不具有转录激活活性。【结论】GbWRKY40可能参与调控棉纤维次生壁发育。     

玉米NAC转录因子片段的克隆及分析

以三叶期玉米幼苗为材料,根据NAC转录因子特有的保守结构设计特异引物,利用RT-PCR技术获得一个玉米NAC转录因子的基因片段,并对该片段进行了测序和生物信息学分析。测序分析结果表明,克隆得到的NAC转录因子基因片段为230 bp,聚类分析结果表明其属于NAC家族的NAM亚类。该片段的获得为克隆玉米NAC转录因子基因全长,进而为玉米抗逆育种奠定了基础。     

阳春砂WRKY40的克隆、分析及原核表达

转录因子可有效调控植物次生代谢产物的生物合成,本研究从姜科药用植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)中克隆获得两个WRKY转录因子基因,命名为AvWRKY 40-1和AvWRKY 40-2。两个基因的编码框分别为852 bp和885 bp,分别编码283和294个氨基酸。Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2编码的蛋白序列一致性为75%,在GenBank中均比对上拟南芥的WRKY 40,且均含有WRKY转录因子家族所共有的WRKKYGQK七肽序列及CX5CX23HNH锌指结构域。系统发育进化树表明:Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2与菠萝(Ananas comosus)的AcWRKY 71亲缘关系最近,且与单子叶植物的WRKY聚为一支。两个基因在阳春砂果皮和种子团中的表达有差异,并且与阳春砂转录组中筛选出来的萜类合酶基因表达相关性也存在差异,AvWRKY 40-1表现出与萜类合酶基因更高的相关性。成功构建了两个基因的重组表达载体pDEST 17-Av WRKY 40-1和pDEST 17-Av WRKY 40-2,经诱导表达得到其融合蛋白。本研究首次克隆阳春砂的WRKY类转录因子基因并获得其融合蛋白,为后续Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2的功能鉴定及其对萜类的代谢调控研究提供基础。     

蒜芥茄黄萎病抗性相关基因SsWRKY22和SsWRKY33的克隆与表达分析

黄萎病是茄子生产中的重要病害之一,严重影响茄子的产量和品质。WRKY转录因子在植物抗病中扮演着重要的角色,但在茄子黄萎病抗性中的作用不明。本研究从黄萎病高抗材料野生蒜芥茄的转录组数据中,筛选获得WRKY家族中的SsWRKY22和SsWRKY33基因,利用PCR技术克隆获得目的基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明,SsWRKY22和SsWRKY33基因的ORF序列大小分别为528和1 073 bp,编码175个和357个氨基酸;蛋白分子量分别为19.19和40.46 kD,均属于亲水性不稳定蛋白,其中,Ss WRKY22编码的蛋白属于酸性蛋白,而Ss WRKY33编码的蛋白属于碱性蛋白,亚细胞定位预测两个基因编码的蛋白均定位于细胞核上;此外,SsWRKY22和SsWRKY33分别属于Ⅱ类和Ⅰ类WRKY转录因子,具有不同的蛋白结构。系统发育分析结果表明,Ss WRKY22与野生潘那利番茄、番茄和马铃薯中的WRKY22亲缘关系较近;而Ss WRKY33与辣椒中的WRKY33亲缘关系最近。利用RT-qPCR对SsWRKY22和SsWRKY33基因在蒜芥茄不同部位(根,茎,叶)的表...     

辣椒WRKY转录因子候选基因的瞬间表达分析

从辣椒cDNA文库中克隆获得一个推定的WRKY（CaWRKY）转录因子,为分析其功能,分别构建启动子区含有双倍W（2W）盒的报告载体和WRKY置于2x35S启动子控制下的超表达载体,通过基因枪瞬间转化技术将两种载体共转化洋葱表皮。检测共转化细胞中GUS基因的表达情况来分析转录因子与特定顺式作用元件的结合及对其转录的激活效应。结果表明CaWRKY能与W盒结合,表明该基因是WRKY转录因子的编码基因。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达

为了进一步明确苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清.本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPV CP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVP CP-Y)基因,将该CP基因连...     

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后, PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

桑黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子片段序列的扩增与分析

采用PCR技术对桑树黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子的部分基因进行扩增,并对扩增片段进行测序及序列分析。结果表明,利用rpF/rpR引物对扩增得到桑黄化型萎缩病植原体核糖体蛋白基因操纵子片段大小为1240bp（GenBank登录号为GQ373255）,该片段包含rps19 基因部分序列,rpl22 和 rps3 基因的全部序列。相似性分析表明,该片段的核苷酸序列与16SrⅠ-rp亚组中各代表植原体的rp基因核苷酸序列的相似性为96.6-99.9%。构建的进化树表明,桑黄化型萎缩病植原体与报道的桑萎缩病植原体（MD）聚类为一个rp亚组,即rpI-B亚组。     

中间锦鸡儿WRKY12基因克隆与生物信息学分析

WRKY转录因子是植物信号网络中不可缺少的部分,是最大的调节子家族之一。本研究从中间锦鸡儿干旱转录组及基因表达检测数据中,挑选出对干旱、冷、盐、碱及ABA都响应明显的CiWRKY12基因,对其进行克隆及生物信息学分析。结果显示:CiWRKY12基因的开放阅读框为696 bp,编码232个氨基酸,含有一个典型的WRKY保守结构域,属于GroupⅡc亚族。对转录因子CiWRKY12与其它8种植物的同源蛋白的理化性质和一、二、三级结构进行生物信息学比较分析,发现这9个蛋白无规则卷曲比例较高,大部分属于不稳定蛋白;亚细胞定位预测表明大部分的蛋白定位于细胞核内;多重序列比对显示WRKY保守结构域保守性很高,其三级结构上也呈现较高的相似性,推测这9个转录因子可能具有相似的转录调控功能。通过本研究生物信息学分析将有助于对CiWRKY12深层次功能研究提供借鉴作用。