绵羊β3肾上腺素能受体基因多态性分析

β3肾上腺素能受体(ADRB3)在高浓度的儿茶酚胺作用下主要作用于脂肪组织调节脂肪分解和产热效应.研究采用PCR-SSCP和测序技术,对12个绵羊品种(系)共962只个体的ADRB3基因的部分序列进行了多态性分析.共检测出A～H等8种基因型,其中基因型B和C的频率较高,为优势基因型,基因型H的频率最低,且只在一个品种中发现.序列测定及比对结果共发现10个核苷酸变异位点,包括一处A碱基的插入.群体的有效等位基因数为2.240,等位基因丰度为6.515.各品种(系)的基因多样性值介于0.050～0.729之间,山西细毛羊的最小,小尾寒羊的最大.表明除山西细毛羊外,其它11个绵羊群体均具有较高的遗传多样性.     

绵羊β3肾上腺素能受体蛋白结构和分子进化分析

β3肾上腺素能受体(ADRB3)是G蛋白耦联受体超家族的成员之一,主要作用于脂肪组织,参与调节脂肪分解和能量代谢。本文基于NCBI上已经发表的14个物种的ADRB3基因mRNA和蛋白质序列,利用网络信息资源和生物学软件,对绵羊等14个物种进行分子进化分析,为进一步研究其表达调控奠定基础。结果表明:该蛋白包含1段50个氨基酸组成的信号肽,是一种具有7个跨膜区结构的不稳定的疏水性膜蛋白。二级结构由α螺旋(23.95%)、β延伸链(20.49%)和无规则卷曲(55.56%)构成;分子进化分析结果显示,14个物种被分成2支,绵羊、山羊、牛、猪、马、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠、猕猴、黑猩猩和人聚为一支,虹鳟鱼单独为一支,该聚类结果和公认的动物分类及进化关系吻合;非同义替换率与同义替换率的比值ω为3.756,说明ADRB3基因发生了正向选择,即受自然选择的作用较大。     

绵羊CS-3基因的克隆及其在绵羊不同组织中的表达研究

试验首次克隆了绵羊CS-3基因序列,预测了CS-3蛋白的结构、功能及其特点,并分析了其在不同组织中的表达情况及CS-3基因与肉质性状的相关性。结果显示,CS-3基因cDNA全长838 bp,完整的开放阅读框(ORF)为70-804 bp,编码244个氨基酸。氨基酸序列中存在3个保守结构域,蛋白质二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,富含疏水区,存在多个磷酸化位点和1个蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的磷酸化位点。通过实时荧光定量RT-PCR技术分析了CS-3基因在凉山半细毛羊部分组织中的表达情况。结果表明,CS-3基因主要在凉山半细毛羊的心脏和肌肉中表达,15 d时各组织中心脏的表达量最高,极显著高于其它各组织(P＜0.01);在心脏和肌肉组织中,CS-3基因的表达量随着年龄的增长而减少,其中在60 d时心脏中的表达量最高。     

DLK1和MSTN基因在绵羊妊娠中后期胎儿中的表达分析

本研究以2个骨骼肌表型差异明显的特克塞尔和乌珠穆沁绵羊为试验对象,研究DLK1和MSTN基因在不同妊娠阶段胎儿不同部位骨骼肌中表达的调控机制及早期肌肉发育规律。在绵羊妊娠第85、100、120和135天时,对胎儿的半腱肌、半膜肌、背最长肌、股四头肌和股二头肌肌肉质量进行方差分析以及对DLK1和MSTN基因在5种骨骼肌中的表达量进行研究。结果表明,妊娠85天时特克塞尔羊的半膜肌、背最长肌、股四头肌和股二头肌质量显著或极显著(P<0.05或P<0.01)高于乌珠穆沁羊;妊娠100天时,5种骨骼肌组织生长发育在品种间的差异达到最大(P<0.05或P<0.01)。实时荧光定量分析表明,随着胎儿日龄的增加,DLK1基因在半腱肌、半膜肌、背最长肌、股四头肌和股二头肌骨骼肌中的表达量有增加的趋势,同时在特克塞尔羊中的表达量高于乌珠穆沁绵羊。在妊娠120天的半腱肌和半膜肌、妊娠100和135天的背最长肌、妊娠85天股四头肌和妊娠135天的股二头肌中DLK1表达量在2个品种间差异显著(P<0.05)。MSTN的表达量在特克塞尔羊中高于乌珠穆沁羊,但整体较低。妊娠135天时背最长肌和股四头肌中MSTN基因的表达量在2个品种间差异显著(P<0.05)。结果显示,DLK1和MSTN基因在不同日龄不同肌肉组织中的差异表达可能与肌肉早期发育有关。     

绵羊CCCH型锌指蛋白基因ZC3H10的mRNA表达研究

为探明ZC3H10基因在绵羊组织及前体脂肪细胞分化过程中的mRNA表达规律,利用转录组测序技术分析ZC3H10在绵羊肾周脂肪、皮下脂肪和尾部脂肪组织的表达模式。利用实时荧光定量PCR技术检测ZC3H10在成体绵羊脂肪组织以及心脏、肾、肝、肺、脾、小肠和肌肉(背最长肌)8种不同器官组织的mRNA表达水平,测定其在体外前体脂肪细胞分化0、2、4、6、8、10d的表达变化。结果显示:ZC3H10在绵羊3个脂肪组织部位均有高水平的mRNA表达,且与脂肪沉积相关基因FABP4和ADIPOQ有相似表达特征;ZC3H10在所检测的组织均有mRNA表达,其在前体脂肪细胞分化0 d的mRNA表达显著高于其他时间点,分化10 d的表达显著低于其他时间点。绵羊ZC3H10 mRNA高表达于脂肪组织,也表达于其他多种器官组织,且在前体脂肪细胞分化过程中呈表达下调趋势,可能在脂肪代谢和脂肪细胞分化中发挥重要作用。     

UCP3基因在巴马猪和藏猪脂肪组织中的表达和甲基化分析

为探究解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的表达和甲基化水平,试验采用实时荧光定量PCR技术检测UCP3基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的mRNA表达水平;针对猪UCP3基因启动子区域（-3 580~+920 bp）,利用在线软件MethPrimer对该区域进行CpG岛预测,并采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测其甲基化水平,探究UCP3基因甲基化水平在巴马猪和藏猪中的差异。结果显示,巴马猪皮下脂肪组织UCP3基因表达量显著高于藏猪（P<0.05）;在UCP3基因启动子区预测到3个CpG甲基化岛,分别是CpG island1（-3 171~-2 928 bp）、CpG island2（-154~-2 bp）和CpG island3（+648~+806 bp）,其中CpG island1和CpG island3的甲基化水平在巴马猪和藏猪中差异较小,而藏猪CpG island2的甲基化水平（42.61%）高于巴马猪（24.49%）。本研究绘制了2个猪种CpG island2甲基化水平的黑白点图,其中CpG位点为4、8、9、10、11、12、15,藏猪甲基化频率分别比巴马猪高28.26%、17.39%、26.09%、26.09%、26.09%、23.91%和34.78%。在CpG island2处预测到3个转录因子结合位点（SP2、PPARγ和EGR1）。结果表明,巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中UCP3基因mRNA水平的表达差异可能是由于CpG island2的甲基化水平不同所导致,藏猪DNA甲基化水平在一定程度上阻碍了转录因子与启动子调控区域的结合,从而抑制了UCP3基因的表达。     

绵羊PRKAG3基因的序列克隆和差异表达

研究以无角陶赛特绵羊为实验材料,对绵羊PRKAG3基因CDS序列进行克隆测序,获得1 395 bp序列。同源建模表明,PRKAG3基因编码蛋白C端由4个保守的CBS结构域组成,为β折叠结构且主要为疏水性氨基酸,在调节AMPK活性方面起着重要作用。BLAST软件分析表明,绵羊PRKAG3基因与牛的同源性最高,其次是人,与猪和小鼠相对较远,同源性分别为96%、84%、82%和81%。利用RT-PCR半定量技术对PRKAG3基因在无角陶赛特绵羊不同组织中的表达进行分析,结果表明:PRKAG3基因在不同组织中表达差异显著,主要在绵羊肌肉组织表达,其次是心脏,在肝脏、脾脏和肾脏中则表达量较少。该结果为绵羊肉质风味的研究提供了分子依据。     

绵羊β_3肾上腺素能受体基因多态性分析

β3肾上腺素能受体(ADRB3)在高浓度的儿茶酚胺作用下主要作用于脂肪组织调节脂肪分解和产热效应。研究采用PCR-SSCP和测序技术,对12个绵羊品种(系)共962只个体的ADRB3基因的部分序列进行了多态性分析。共检测出A～H等8种基因型,其中基因型B和C的频率较高,为优势基因型,基因型H的频率最低,且只在一个品种中发现。序列测定及比对结果共发现10个核苷酸变异位点,包括一处A碱基的插入。群体的有效等位基因数为2.240,等位基因丰度为6.515。各品种(系)的基因多样性值介于0.050~0.729之间,山西细毛羊的最小,小尾寒羊的最大。表明除山西细毛羊外,其它11个绵羊群体均具有较高的遗传多样性。     

PPARα和PPARγ基因在不同脂尾型绵羊脂肪组织中的发育性表达研究

为研究PPARα和PPARγ基因在不同脂尾型绵羊脂肪组织中的发育性表达规律,以探讨这2个基因与绵羊脂肪代谢的关系。本研究以2个具有显著尾型差异的绵羊品种(广灵大尾羊和小尾寒羊)为研究对象,用实时荧光定量方法研究PPARα和PPARγ基因在2、4、6、8、10和12月龄个体的7种脂肪组织(大网膜、小网膜、尾部脂肪、皮下脂肪、肠系膜、肾周脂肪、腹膜后脂肪)中的mRNA的表达。结果表明,PPARα和PPARγ在各脂肪组织中都有表达。总体而言,浅层脂肪组织中的表达量低于深层脂肪组织。作为主效应,品种和月龄基本不影响2个基因的mRNA表达。尽管性别对PPARα的表达无显著影响,但在广灵大尾羊母羊中PPARγ的低表达导致性别本身及其与品种的互作达显著水平。鉴于组织间和年龄间的表达差异,这2个基因的表达具有明显的空间性,但时间性不明显。尽管二者在调节脂肪代谢方面的功能相反,但是存在协同作用。     

绵羊PDGFD基因克隆及其在不同部位脂肪组织中的表达

试验旨在获得绵羊血小板源性生长因子D （PDGFD）基因的编码区（coding sequence,CDS）全长序列,并了解其在体内不同部位脂肪组织中的表达规律。以阿勒泰母羊和中国美利奴母羊为研究对象,克隆获得了PDGFD基因CDS区全长序列并对其进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法对PDGFD基因在2个品种羊沉积在尾部、肠系膜、背部和肾脏周围4个不同部位脂肪组织中的表达水平进行定量分析。结果显示,绵羊PDGFD基因CDS区序列长度为1 113 bp,编码370个氨基酸;PDGFD基因CDS区序列及其编码序列与山羊的相似性最高,其次是牛、猪、马、人,与鼠的相似性最低,系统进化树分析结果与其一致;预测PDGFD蛋白属于稳定的亲水性蛋白,且无跨膜区,存在信号肽序列,属于分泌型蛋白;PDGFD蛋白含有1个糖基化位点、1个CUB结构域和1个PDGF结构域,PDGFD蛋白二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲构成,三级结构与结构域和二级结构分析结果基本吻合。实时荧光定量PCR结果显示,PDGFD基因在阿勒泰羊4个脂肪组织的表达量均高于中国美利奴羊,其中阿勒泰羊尾脂和背部脂肪的表达量显著高于中国美利奴羊（P<0.05）。本研究结果为进一步探究PDGFD基因在绵羊脂肪沉积中的作用机制提供参考。     

乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和降睾中的表达研究

实验检测3乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达情况。提取绵羊睾丸组织、附睾头、体、尾部组织总RNA，以此为模板，逆转录合成cDNA，自行设计引物，PCR扩增出347bp的目的DNA。然后，将目的片段克隆入T载体，通过菌液PCR和重组质粒酶切，鉴定重组质粒中的目的DNA。再经序列分析鉴定目的片段。同时，以β-actin为内参照物，进行RT—PCR半定量分析，比较在睾丸、附睾头、体、尾部组织中的表达量。结果表明：乳酸脱氢酶-C4在绵羊睾丸中表达量最多，尾部中表达不明显。     

GPR54基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位研究

试验旨在研究GPR54(G-protein coupled receptor 54)基因在绵羊不同组织中的表达及其在4~6月龄公羔睾丸组织中的表达特性及定位。本研究采用实时荧光定量PCR法检测各组织GPR54 mRNA表达规律,以及其在不同月龄公羔睾丸中的表达量,运用免疫组化技术对睾丸中GPR54基因进行定位分析。结果显示,GPR54在不同组织中均有不同程度的表达,其中在下丘脑、垂体和睾丸中大量表达;GPR54在4~6月龄绵羊公羔睾丸组织中呈阶段性表达,6月龄表达量显著高于4和5月龄(P<0.05);4月龄时,在精原细胞和极少数的初级精母细胞中检测到较弱的阳性信号;6月龄性成熟时,在睾丸中分裂早期的精子细胞检测到强阳性信号。综上表明,GPR54基因在绵羊不同组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要的作用,并与动物的性成熟及雄性动物精子发生过程有密切的关系。     

绵羊PER3基因组织表达及多态性与季节性繁殖的相关性研究

为了探究PER3基因的组织表达水平及其多态性与绵羊季节性繁殖的关系,为绵羊育种提供理论基础,该试验通过实时荧光定量PCR(qPCR)研究PER3基因在季节性发情的苏尼特羊和常年发情的小尾寒羊松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中的表达情况,同时利用SequenomMassARRAY~(○R)SNP技术对季节性发情绵羊品种(草原型藏羊、苏尼特羊、滩羊共204只)和常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊共564只)PER3基因的13个SNPs进行分型检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:PER3基因在绵羊的松果体、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管以及子宫组织中均有表达,且其在季节性繁殖的苏尼特羊的表达均高于常年发情的小尾寒羊(卵巢组织除外),在松果体和子宫组织中达到显著差异水平(P0.05);分型结果表明,在该实验室前期通过重测序得到的PER3基因13个SNPs中,g.43657503AG、g.43670012TC、g.43670807AG、g.43677259TC和g.43707227GA 5个SNPs在季节性发情和常年发情绵羊品种之间的基因型频率、等位基因频率均达到显著差异水平(P0.05);关联分析结果表明,PER3基因的13个SNPs与小尾寒羊产羔数并无显著关联(P0.05)。该研究表明,PER3基因在松果体、下丘脑和垂体等繁殖相关组织的表达,在苏尼特羊中均高于小尾寒羊,暗示着较高水平的PER3的表达可能与绵羊的季节性发情调控有关。     

不同饲养环境合作猪脂肪组织生脂基因 mRNA表达水平的比较研究

合作猪是生长在高寒草原以放牧为主的珍稀高原型猪种,为了探讨其品种特性的分子机制,分析测定了原产地合作猪及长期在不同环境和饲养条件下异地饲养合作猪脂肪组织脂肪生成的关键酶脂肪合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)1和转录因子固醇调控元件结合蛋白(SREBP)-1c、碳水化合物调控元件结合蛋白(ChREBP)mRNA表达水平,并与杜×大×长三元杂交猪进行了对比。试验结果发现,合作猪脂肪组织FAS、ACC1及ChREBP mRNA水平显著低于三元杂交猪(P<0.05),在长期异地饲养后,这些基因mRNA表达水平提高(P<0.05),而SREBP-1c mRNA表达水平在3个群体中没有明显变化(P>0.05)。结果提示,合作猪由于对低能量、低碳水化合物粗饲的长期适应,表现出脂肪组织生脂基因表达水平较低的生理学特性。     

VEGF在绵羊卵巢中的表达分布研究

目的:研究血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在绵羊卵巢组织中的免疫定位.方法:选取绵羊的卵巢组织作为研究样本,制成切片,通过HE染色来观察其卵巢的形态结构,采用免疫组织化学SP法检测绵羊卵巢中VEGF的表达分布.结果:VEGF在绵羊卵巢各级卵泡中均有表达,...     

PRELID3B基因mRNA在不同品种乌骨鸡肌肉组织中的表达规律研究

PRELID3B基因（PRELIP Domain Containing 3B）是调控乌骨鸡黑色素沉积的重要候选基因。为探讨PRELID3BmRNA在不同品种乌骨鸡肌肉发育中的表达情况,以丝羽乌骨鸡和余干乌骨鸡为材料,采用实时荧光定量PCR技术,检测出雏后不同发育时期胸肌和腿肌中PRELID3BmRNA的表达情况,并将基因表达量与肌肉色度L值进行相关性分析。结果发现,2个品种胸肌和腿肌的肌肉色度L值都随日龄的增长呈逐渐下降的趋势;2周龄后,2个品种的胸肌和腿肌L值出现差异（P<0.05）。丝羽乌骨鸡胸肌和腿肌PRELID3B mRNA表达变化趋势基本一致,都是前高后低;余干乌骨鸡胸肌和腿肌PRELID3BmRNA表达变化趋势不一致,其中胸肌在10周龄之后呈升高的趋势。14周龄之后,2个品种的胸肌和腿肌PRELID3BmRNA表达都出现差异（P<0.05）。品种间比较,14周龄之后胸肌PRELID3BmRNA表达在品种间出现差异（P<0.05）;腿肌则是在2周龄、6周龄和14周龄时品种间出现差异（P<0.05）。肌肉色度L值与基因表达的相关性结果显示,2个品种的腿肌...     

乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达研究

实验检测3乳酸脱氢酶-C4基因mRNA在绵羊睾丸和附睾中的表达情况。提取绵羊睾丸组织、附睾头、体、尾部组织总RNA,以此为模板,逆转录合成cDNA,自行设计引物,PCR扩增出347bp的目的DNA。然后,将目的片段克隆入T载体,通过菌液PCR和重组质粒酶切,鉴定重组质粒中的目的DNA。再经序列分析鉴定目的片段。同时,以β-actin为内参照物,进行RT-PCR半定量分析,比较在睾丸、附睾头、体、尾部组织中的表达量。结果表明:乳酸脱氢酶-C4在绵羊睾丸中表达量最多,尾部中表达不明显。     

胃泌素及其受体基因在绵羊部分组织中表达量的检测

为了探究胃泌素(GAS)及其特异性CCK-B受体(CCK-BR)在反刍动物各组织的分布量,用实时荧光定量PCR方法检测了4只新疆细毛羊各组织中GAS和CCK-BR基因的相对表达量,用2~(-△△Ct)法比较Ct值。结果显示,GAS基因在皱胃窦中表达量最高(1 321±482),且极显著高于其他组织(P0.01),而其他组织之间差异不显著(P0.05);CCK-BR基因在皱胃底中表达量最高(62.5±11.5),且极显著高于其他组织(P0.01),在垂体表达量极显著高于除皱胃底以外的其他组织(P0.01),在空肠、瓣胃、睾丸和肺中的表达量显著高于肾上腺和肾(P0.05),其他各组织之间差异不显著(P0.05)。说明反刍动物GAS主要来源于皱胃窦,而且主要在皱胃底和垂体等部位发挥生物学作用。     

绵羊CS-1基因的克隆及在凉山半细毛羊不同组织中的表达

旨在研究绵羊CS-1基因序列及其蛋白质的结构与功能以及其在不同组织中的表达情况,进而预测其与肉质性状的关联性.Calsarcins(Calcineurin-associated sarcomeric protein,CS)家族是一个与钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)相结合的肌纤维特异表达蛋白新成员,CS-1基因是与畜禽肉质性状密切相关的重要候选基因.本研究根据牛、人和鼠CS-1基因mRNA,应用比较基因组学技术成功克隆了绵羊CS-1基因全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行生物信息学分析.结果显示,该基因cDNA全长951 bp,完整的开放阅读框(ORF)为79～872 bp,编码264个氨基酸.氨基酸序列中存在3个保守结构域,蛋白质二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,富含疏水区,存在多个磷酸化位点和1个蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)的磷酸化位点.通过实时荧光定量RT-PCR技术分析CS-1基因在凉山半细毛羊部分组织中的表达情况.结果表明:CS-1基因主要在凉山半细毛羊的心脏和背肌中表达,15 d在心脏的表达量最高,极显著高于其它各组织(P＜0.01);在心脏和背肌中,CS-1基因的表达量随着年龄的增长而减少,其中在60 d时心脏中的表达量最高.研究结果为绵羊的肉质性状改善提供科学依据.