发酵乳酸杆菌F6对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响

采用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR）检测益生性发酵乳酸杆菌F6刺激鸡小肠上皮细胞后抗菌肽β-防御素-9（AvBD9）基因表达变化,为从益生菌与上皮细胞抗菌肽表达关系的新角度解析益生菌发挥益生作用的新途径和机制提供一定的基础及依据。利用不同剂量（2×105,2×106,2×107 CFU）的发酵乳酸杆菌F6分别刺激原代培养的鸡小肠上皮细胞4h,提取刺激后的细胞总RNA,反转录为cDNA,FQ-PCR检测抗菌肽AvBD9基因表达变化。结果表明,未受刺激的正常对照组也检测到AvBD9mRNA的表达,发酵乳酸杆菌F6能上调AvBD9基因表达。刺激组中AvBD9mRNA的表达在不同剂量组之间存在差异。2×105 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量极显著高于未受细菌刺激的对照组和2×106 CFU/mL组（P〈0.01）,显著高于2×107 CFU/mL组（P〈0.05）。2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量显著高于未受细菌刺激的对照组（P〈0.05）,但2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组之间无显著差异（P〉0.05）。发酵乳杆菌F6与鸡小肠上皮细胞相互作用过程中可提高抗菌肽AvBD9mRNA的表达,且存在剂量依赖性。     

玉屏风散对小鼠β防御素-2基因表达的影响

研究玉屏风散益气固表、提高机体对环境病因抵抗力的机理。实验组6只小鼠以玉屏风散水煎液灌胃10 d,对照组6只小鼠给予同体积生理盐水,处死动物后提取肺组织总RNA,通过实时荧光定量PCR测定小鼠在灌服玉屏风散水煎液后β防御素-2基因表达水平。结果实验组小鼠β防御素-2基因的相对表达量是对照组的9.327倍。表明玉屏风散增强机体抵抗力与其可上调β防御素-2基因的表达从而提高机体非特异性免疫力有关。     

灭活枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

以体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(ovine rumen epithelial cells,ORECs)为试验模型,旨在探究灭活枯草芽孢杆菌对ORECs绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响.首先用不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌(107、108、109、1010、1011 CFU/mL)诱...     

枯草芽孢杆菌细胞壁对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheep β-defesin-1,SBD-1)的表达产生影响,先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并成功收集其细胞壁,将不同浓度(0、25、50、100、2...     

乳酸杆菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的表达

为了解不同乳酸杆菌的刺激对绵羊瘤胃上皮细胞中绵羊β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)的可能调节作用,本研究选用了2株具有益生作用的乳酸杆菌,即干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)和植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8),首先,运用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)检测与乳酸杆菌共培养后的绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1mRNA的相对表达量;其次,探讨了2株乳酸杆菌诱导SBD-1 mRNA表达的差异性,选取优势菌株;最后,运用RTq PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法,检测优势菌株活菌、灭活菌及其培养上清液对SBD-1基因及蛋白水平表达的影响。结果表明:2株乳酸杆菌均能促进SBD-1 mRNA的相对表达量,乳酸杆菌的浓度为107CFU/m L、刺激细胞8 h时能极显著促进SBD-1 mRNA的相对表达量(P0.01),而L.plantarum P-8强于L.casei Zhang;进一步的研究表明L.plantarum P-8的灭活菌亦可显著诱导SBD-1的基因及蛋白表达(P0.05),但弱于活菌。本研究结果表明L.plantarum P-8和L.casei Zhang均可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的差异性表达。     

17-β-雌二醇对培养的绵羊输卵管上皮细胞β-防御素(sBD-1)mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,根据体内雌激素浓度确定17-β-雌二醇添加的浓度分别为10-8、10-9、10-10、10-11mol/L,提取细胞总RNA,利用实时荧光定量RT-PCR测定sBD-1-mRNA的相对表达量.结果显示:一定浓度范围内(10-8、10-9、10-10mol/L),17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞sBD-1-mRNA的表达有促进作用,且呈正相关.结果表明:雌性生理周期下,雌性生殖道sBD-1-mRNA的表达与雌激素相关.     

鸡β-防御素CDNA的克隆与序列分析

使用总RNA提取试剂盒,从1月龄粤黄鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-2)cDNA片段.PCR产物经凝胶回收纯化,加A尾后与载体pGEM-T Easy相连,然后转化感受态细胞DH-5α在含X-gal、IPTG的LA平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与提取质粒作限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序.结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为195bp,用Blast程序进行检索比较表明此扩增序列与Genbank中发表的鸡Gal-2 cDNA编码区序列100%相同.该cDNA编码64个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由36个氨基酸残基组成.     

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2表达的影响

研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2(SBD2)基因表达的影响,探讨P4调节SBD2表达的潜在机制。建立绵羊输卵管上皮细胞体外培养体系,用不同浓度(10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L)P4分别处理绵羊输卵管上皮细胞0、2、6、12、24、48h,筛选P4诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD2mRNA表达的最佳条件。然后使用10-6mol/L孕激素核受体拮抗剂RU486,50μmol/L蛋白激酶C(PKC)信号通路阻断剂H7预处理细胞1h,再使用P4诱导SBD2mRNA表达的最佳条件处理细胞,同时设只添加阻断剂(RU486和H7)处理组、只添加孕酮(P4)处理组和空白对照组,通过RT-qPCR技术检测SBD2mRNA的表达变化。10-9mol/LP4诱导绵羊输卵管上皮细胞6h和24h时SBD2mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且与P4组相比,添加RU486和H7后显著抑制了P4诱导的SBD2mRNA的表达水平(P<0.01)。P4以浓度和时间依赖性方式显著增加SBD2mRNA表达,并且诱导可能通过孕酮核受体(PR)介导的基因组途径以及PKC信号通路来提高绵羊输卵管上皮的先天免疫防御能力。     

未孕和3个月孕龄的小尾寒羊子宫内膜β-防御素的表达研究

β-防御素主要分布于哺乳动物黏膜上皮细胞内,是黏膜表面抗微生物屏障的组成成分.小尾寒羊是重要的家畜之一.应用实时荧光定量PCR技术,分别对未孕和孕龄3个月的小尾寒羊子宫内膜β-防御素mRNA的表达进行了荧光定量PCR检测和分析,结果表明,在未孕子宫和怀孕子宫内膜组织中均有β-防御素mRNA的表达,但怀孕的子宫内膜组织中的表达量高于未孕子宫,说明β-防御素在生殖生理中有着重要的作用,为进一步研究生殖生理中的免疫防御机制奠定理论基础.     

鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

为制备鸡β-防御素-9(AvBD9)多克隆抗体,本试验将AvBD9基因插入pGEX-6 P-1载体,构建重组基因pGEX6 P-AvBD9大肠杆菌表达质粒。将通过切胶纯化获得的表达产物包涵体谷胱甘肽转移酶-AvBD9(GST-AvBD9)融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗AvBD9血清,并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫分析(ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶38 400。     

鸡β-防御素Gallinacin-8基因片段的克隆与序列分析

本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础.     

鸡β-防御素及其应用前景

防御素是生物界广泛存在的一类具微生物抗性的低分子肽，由于其抗菌谱最广，具有很高的应用潜力。本文概述了鸡β-防御素的分子结构、抗菌活性、基因表达调控的研究进展，并展望了其在畜牧业中的应用前景。     

鸡β-防御素基因的克隆、序列分析及其在组织中的分布

本研究采用RT-PCR法，分别从鸡肝脏和舌组织中扩增到鸡β-防御素（Gallinacin，Gal）Gal-6、Gal-8与Gal-9基因，经序列测定表明，Gal-6、Gal-8和Gal-9大小分别为201、204和201bp，其成熟肽分别由67、68和67个氨基酸残基组成。组织表达分析表明，Gal-6基因在鸡体内各组织器官中广泛地表达，在鸡皮肤、舌、心脏、小肠、胸肌、肝脏、肾脏、法氏囊、脾脏和胰腺中表达量较高；在肺脏、睾丸和骨髓中也有一定量表达。相比之下，Gal-8在鸡体内的表达较为局限，Gal-8基因仅在舌、小肠、肺脏和肝脏中大量表达。Gal-9基因在鸡体内组织中分布也较广泛，在舌和小肠中大量表达，在气管、肺脏、肝脏、肾脏、骨髓和胸腺有少量表达。     

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示：(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆...     

鸡β-防御素研究进展

抗菌肽是由动物和植物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,具有广谱抗菌活性。抗菌肽的生成和释放是机体炎症反应的组成部分,是宿主     

重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因.经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204 bp,编码68个氨基酸残基.根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树.发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%.将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达.SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32 ku.对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定.结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性.重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250 μg/mL.此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性.     

鸡β-防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

鸡β-防御素是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal-2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM-TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM-T-Gal-2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL-c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL-c2x-Gal-2重组质粒。     

鸡肝脏组织中防御素基因片段的克隆

作为动物体内防御系统最大的成员,鸡beta-defensin是鸡体内唯一存在的防御素种类,实验选取本实验室自行饲养的罗曼鸡作为实验材料,从鸡的肝脏提取总RNA运用RT-PCR技术克隆出鸡β-防御素cDNA片段Gallinacin-1、8、9、10,并进行测序,为进一步进行表达做了一项基础工作。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

哺乳动物β-防御素研究进展

防御素是广泛分布于动植物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,它在先天性免疫系统宿主防御机制中起着重要的作用。笔者从哺乳动物β-防御素的组成分布入手,对β-防御素的分子结构与染色体定位、基因表达调控、生物学作用及应用前景等最新研究作一全面综述。