柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析

预测并克隆柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2 (EtRON2)基因,分析其结构特点及与顶复门其他虫属间的差异.本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2(EtRON2)的基因序列,用RT-PCR方法扩增出Etron2全长ORF;以E.tenella 子...     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

柔嫩艾美耳球虫病毒的鉴定

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。感染鸡的艾美耳属球虫中,国外已报道在巨型艾美耳球虫（E.maxima）,堆型艾美耳球虫（E.acervu-lina）,毒害艾美耳球虫（E.necatrix）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）中发现了病毒粒子或病毒RNA。但是作为危害最严重的柔嫩艾美耳球虫是否有病毒感染,国内外迄今尚无报道。本研究首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并对其进行了鉴定。通过核酸分析、RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和电镜形态观察对病毒进行鉴定。核酸酶的敏感性试验结果表明在柔嫩艾美耳球虫总核酸电泳图谱上观察到的大小分别为1.4、2.4和3.6kb的3条病毒带均不能被DNA酶（100mg/L）降解,但可被RNA酶（1.0mg/L）降解,表明这些核酸为RNA。另外,这些核酸不能被高盐浓度（0.3mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,但可被低盐浓度（0.015mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,并且采用α-32P标记的UTP掺入法测得该病毒样核酸具有RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）活性,表明这些核酸为双链RNA（dsRNA）。利用蔗糖梯度离心和透射电镜技术对柔嫩艾美耳球虫病毒进行了分离和鉴定。电镜负染观察到柔嫩艾美耳球虫病毒粒子外观呈球形,二十面体,无囊膜,直径38nm。     

柔嫩艾美耳球虫EtMIC2的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统展示柔嫩艾美耳球虫微线蛋白基因EtMIC2,为下一步研制活载体疫苗奠定基础。参照GenBank中柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫的RNA为模板,利用RT-PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到酿酒酵母表面展示的载体pCTCON2,转化大肠杆菌TOP10,提取阳性质粒转化酿酒酵母菌株EBY100,诱导表达后,用抗EtMIC2蛋白质特异性抗体,做间接免疫荧光(IFA)检测EtMIC2蛋白的表达。结果显示,EtMIC2成功展示到酵母细胞表面,测得最佳诱导时间为48h。     

柔嫩艾美耳球虫EtMIC2的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统展示柔娥艾美耳球虫微线蛋白基因EtMIC2,为下一步研制活裁体疫苗奠定基础。参照GenBank中柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫的RNA为模板,利用RT—PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到酿酒酵母表面展示的载体pCTCON2,转化大肠杆菌TOPl0,提取阳性质粒转化酿酒酵母菌株EBYl00,诱导表达后,用抗EtMIC2蛋白质特异性抗体,做间接免疫荧光（IFA）检测EtMIC2蛋白的表达。结果显示,EtMIC2成功展示到酵母细胞表面,测得最佳诱导时间为48h。     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列(克隆号为M20),采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

2株柔嫩艾美耳球虫对5种抗球虫药的抗药性

选择130只21日龄雏鸡，研究了柔嫩艾美耳球虫（E.tenella)南京株和凤阳株对地克珠利（Diclazuril)、马杜霉毒（Maduramicin)、氯羟吡啶（Clopidol)、氯苯胍（Robenidine)和氨丙啉（Amprolium)的抗药性。试验鸡随机分成13组，其中每株球虫均设5个感染用药组，1个感染不用药组，另设1个不感染不用药组，每组10只鸡。以POAA，RLS，ROP，ACI作为指标。结果表明，2株柔嫩艾美耳球虫均对氨丙啉轻度抗药，对地克珠利敏感或轻度抗药，对氯羟吡啶中度抗药。对马杜霉和氯苯胍中度抗药或安全抗药。提示：目前在凤阳地区可合理地使用地克珠利和氨丙啉，对氯羟哟啶应慎用，对马杜霉素和氯苯胍须减少或暂停使用。     

弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5（Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5）基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期（速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊）中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。     

Study on Expression of Toxoplasma gondii Rhoptry Neck Protein 5 Gene in Different Developmental Stages

To investigate the relationship between the expression level of Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5 (TgRON5) gene in different developmental stages and the virulence of Toxoplasma gondii, the objective of this study was to examine the different expression of TgRON5 gene in different developmental stages of type Ⅱ Toxoplasma gondii PRU strain. Specific primers were designed according to the sequence of TgRON5 gene, and ACT1 gene of Toxoplasma gondii was used as a reference gene. Following the establishment of standard curve for the target and reference genes, in order to confirm the consistency of their amplification efficiency, Real-time PCR method was applied to determine and compare the expression level of TgRON5 gene in development stage which including tachyzoite, bradyzoite, non-sporulated oocyst and sporulated oocyst. The results demonstrated that TgRON5 was expressed in all developmental stages but the sporulated oocysts had the highest expression, followed by the non-sporulated oocysts, the third was tachyzoite, and the lowest was bradyzoite. It suggests that the synthesis and secretion of TgRON5 protein was closely associated with the invasiveness of the parasite. All these findings had important implications for elucidating the functions of TgRON5 involved in the invasion of Toxoplasma gondii.     

牦牛PLIN2基因的克隆及其在卵巢不同发情阶段的表达

试验旨在研究牦牛PLIN2基因的序列特征和表达特性,并分析其表达与不同发情时期的卵巢的相关性。根据GenBank中已知的普通牛序列,设计克隆引物,经RT-PCR扩增得到牦牛PLIN2基因序列。RT-PCR检测PLIN2基因在各个组织中的表达量,实时荧光定量PCR分析卵巢不同发情时期的表达量。结果表明,牦牛PLIN2基因的编码区长为1 353 bp,共编码450个氨基酸,为无跨膜结构的非分泌蛋白。与GenBank中已知的普通牛序列同源性达到99.4%,表明PLIN2基因在进化过程中相当保守。在牦牛的各个组织中PLIN2分布广泛,但不同组织中的表达有差异,卵巢、乳腺、胃和肾脏中相对较多,而肺脏中几乎没有表达。实时荧光定量PCR结果显示,在卵巢的不同发情时期PLIN2都有表达,且在黄体期的表达量最高,表明PLIN2基因在牦牛发情周期中起着不可忽视的作用。     

Cloning of PLIN2 Gene of Yak and Its Expression in Ovary during Different Estrus Periods

The purpose of this study was to research the sequence characteristics and the expression of PLIN2 gene, and to analyze the relationship between the expression and the ovaries in different estrus periods. According to the gene sequence of bovine in GenBank, the primer was designed. The PLIN2 gene of yak was cloned by RT-PCR, and the expression quantity of the PLIN2 gene in different tissues of yak was detected by the semiquantitative RT-PCR. Meanwhile,the differential expression of the PLIN2 gene in different ovarian estrus periods of yak was detected by quantitative Real-time PCR. The results showed that the length of the PLIN2 gene was 1 353 bp in CDS, encoding 450 amino acids. The PLIN2 protein was predicted to be non-seretory and lacking cross-membrane domain. It was 99.4% homology identity to that of corresponding cDNA from bovine, which showed that the PLIN2 gene was quite conservative in the process of evolution. The expession profile of PLIN2 was wide in yak tissues, but there were some differences in different tissues. The expression quality was higher in kidney, breast and ovary, while it was almost nothing in lung. The result of quantitative Real-time PCR indicated that yak PLIN2 gene was expressed in different ovarian estrus periods, and the highest expression during the luteal phase, which indicated the PLIN2 gene played an essential role in yak estrous cycles.     

藏鸡和隐性白羽鸡感染柔嫩艾美耳球虫后免疫相关基因的表达变化分析

试验旨在从免疫遗传学的角度初步探讨藏鸡（TC）和隐性白羽鸡（RWC）对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）易感性差异的分子机制,分别用1×10⁵个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染对球虫具有抗性的藏鸡和易感的隐性白羽鸡。应用实时荧光定量PCR检测藏鸡和隐性白羽鸡感染前0 d和感染后第2、4、6和8天脾脏、盲肠、胸腺、法氏囊中γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-16、Toll样受体（TLR3）和TLR15免疫相关基因的转录水平变化。结果显示,藏鸡脾脏IFN-γ、IL-2、IL-16及TLR3、TLR15免疫相关基因转录水平于感染后第4和8天明显上调,隐性白羽鸡则无明显变化。藏鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第2天显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第4天起显著上调（P<0.05）,其余免疫相关基因变化幅度不大;隐性白羽鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第8天显著上调（P<0.05）,IL-2在感染后第2天起显著上调（P<0.05）,IL-16在感染后第6天起显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第2和8天显著上调（P<0.05）,TLR15变化幅度不大。各免疫相关基因在2个品种鸡胸腺和法氏囊中均出现上调或下调,但除藏鸡法氏囊TLR3和TLR15转录水平变化幅度相对较大外,其余免疫相关基因与感染前相比变化幅度不大。以上结果显示,球虫感染主要导致藏鸡和隐性白羽鸡脾脏和盲肠中的各免疫相关基因出现显著变化,表明宿主的遗传背景在一定程度上可影响球虫感染的免疫应答。     

猪MEF2a基因的克隆与表达

为了进一步了解猪MEF2a基阒的结构与功能,本研究采用生物信息学结合RT-PCR的方法,克隆了猪的MEF2a基因,获得了它的2个变异体序列.结果表明,猪MEF2a variant 1基因cDNA长1 524 bp(EF576923),编码508个氨基酸,分子量为54.481 ku;variant 2基因cDNA长1 416 bp(EF576922),编码471个氨基酸,分子量为50.846 ku.MEF2a两个变异体的氨基酸序列同源性为86.79%,第1aa～77aa和第132aa～470aa完全一致,第78aa～131aa是高变区,variant2与variant1相比,在第224aa～258aa处存在34个氨基酸(102 bp)的,缺失.利用Real-time PCR方法检测了MEF2a的表达.结果表明,MEF2a mRNA是一个广谱表达基因,在心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、背肌和腿肌中都能检测到,在腿肌中优势表达.MEF2a variant1与马和家鼠构成一个小类群,而variant 2与牛和人构成了另外一个小类群,推测MEF2a基因在进化过程中发生了较为明显的变异.     

ETMIC-2基因表达产物对人工感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的保护及病理学研究

采用大肠杆菌表达鸡艾美耳球虫微线蛋白(ETMIC—2)，对石歧杂小公雏在1、2周龄按分组以不同剂量分别肌注免疫，3周龄人工感染强毒柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，4周龄全部捕杀，进行增重、盲肠病变和免疫淋巴器官病理组织学观察。结果表明，全部试验组增重率均高于红对照组，其中两组超过白对照组；盲肠病变均低于红对照组；免疫淋巴器官发生不同程度的增生，尤其是胸腺，盲肠扁桃体及脾脏，淋巴滤泡增大，淋巴细胞明显增殖。此结果可以提示，适量的ETMIC—2基因表达产物免疫雏鸡后，再进行柔嫩艾美耳球虫的强毒攻击，能刺激机体的免疫淋巴组织器官产生免疫应答反应，对机体具有较好的保护力。     

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究EtMIC3基因遗传变异情况。结果获得2976 bp的目的片段,各株与FJ374765.1 CDs的序列相似性在99.8%~99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%~100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%~99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。     

三穗麻鸭Cofilin2基因序列分析及其组织表达研究

为探究三穗麻鸭丝切蛋白2（Cofilin2）基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测Cofilin2基因在三穗麻鸭不同组织中的表达情况。结果显示,三穗麻鸭Cofilin2基因编码区大小为498 bp,可编码166个氨基酸;三穗麻鸭Cofilin2基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示,Cofilin2基因在不同物种进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构呈弯曲螺旋结构;实时荧光定量PCR检测显示,三穗麻鸭Cofilin2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、腿肌和法氏囊等组织器官中均有不同程度表达,其中心脏中表达量最高,法氏囊中表达量最低。本试验结果为三穗麻鸭抗病分子机理研究奠定了基础。     

如皋鸡不同时期肌肉组织生长相关基因的表达谱分析

旨在了解如皋鸡不同时期肌肉生长发育机制。本研究利用基因芯片技术,分析在不同生长阶段下(2～12周龄)如皋鸡肌肉组织基因的表达情况。获得了13 379个基因的差异表达动态图谱。在不同生长阶段下肌肉组织生长基因的表达发生变化,与2周龄相比,4和12周龄下调表达的基因数量多于上调表达的基因数量,6、8和10周龄下调表达的基因数量少于上调表达的基因数量。同时对杂交数据进行多种聚类分析。利用实时荧光定量PCR验证4个基因的差异表达,其结果和芯片杂交分析的结果基本一致。初步建立了不同时期肌肉生长应答基因的动态表达谱,比较全面地获得了肌肉生长应答基因,初步揭示了如皋鸡不同时期肌肉生长发育机制。