禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度，通过测定已知鸡胚半数致死量（ELD50）的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚，对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量（ELD50）的测定，结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-7.75/0．2mL，H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-8.5／0．2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释，进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定，结果发现：试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-5倍稀释液，该稀释液含有281ELD50病毒量；检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-8倍稀释液，该稀释液含有15．8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时，试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和（或）泄殖腔拭子所采集的病毒量，能够满足检验检疫的实际需要。     

实时荧光PCR技术快速定量检测H5亚型禽流感病毒

选取H5亚型禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)基因保守序列,使用Primer Express 2.0软件设计出特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光PCR技术来定量检测禽流感病毒。使用含有选定检测序列的RNA标准品做标准曲线,结果表明该方法的灵敏度为10拷贝/反应,标准曲线的相关系数为0.998003,对H9亚型禽流感病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳。为禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。     

H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用

H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大。为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化。以本实验室分离测序确定的30份H5亚型禽流感病毒RNA为模板,将该方法与两种商品化H5亚型禽流感病毒检测试剂盒进行比对,发现该方法与两种商品化试剂盒的检出率分别为100%、98%、98%。敏感性试验显示,该方法可以检测出0.1 fg的RNA模板,灵敏度比两种商品化试剂盒均提高了10倍。结果表明,该方法具有更高的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感的早期诊断。     

H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型,因而对其进行病毒的监测与诊断显得极其重要。通过比对GenBank上H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了一个特异性针对H9 AIV HA的探针。特异性和扩增曲线实验结果显示,该探针具有较好的扩增效率,且仅特异性识别H9亚型AIV。通过重组质粒pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。实验结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法敏感性能达到100个DNA拷贝数,比传统PCR方法检测敏感性提高了1000倍。此外,本方法还能检测到10EID50个病毒,比传统PCR方法检测敏感性也提高了1000倍。通过批间和批内试验,结果表明,这两个试验的变异系数分别小于5%和1%,说明本研究的方法具有较好的重复性。此外,通过检测人工感染动物咽拭子,结果表明H9亚型AIV荧光定量PCR方法比传统PCR的方法检测敏感性提高了100倍。在临床样品的检测中,H9亚型AIV荧光定量PCR方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了大约30%。综上所述,本研究所建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确性和敏感性,对H9亚型禽流感疫情防控及其流行病学调查具有积极的科学意义。     

禽流感病毒三种病原学检测方法的比较研究

为了分析比较不同的商品化检测方法在禽流感病毒快速诊断中的实用性,本试验运用禽流感高敏快速荧光免疫法、胶体金免疫层析纸条法和实时荧光RT-PCR三种方法同时对禽流感病毒H5、H7和H9三个亚型抗原各12个稀释度的样本进行检测。结果表明,禽流感高敏快速荧光免疫法对三种亚型抗原的灵敏度较高,各亚型检出最低稀释度分别为H5:1∶2 560,H7:1∶1 280,H9:1∶640,该方法快捷简便,且设备便携,通过云平台处理数据,适用于现场即时检测(POCT)等;进口胶体金免疫层析纸条法对H5、H9亚型抗原的灵敏度高,对H7亚型抗原的灵敏度较低,且国内产品存在假阳性、准确性较低等缺点,但均操作简单,适用于基层初筛;实时荧光RT-PCR法对三种亚型抗原的灵敏度高,稀释度均可达1∶40 960以上,但耗时长,设备和技术要求相对较高,更适用于实验室确诊。     

防治禽流感8项国家标准发布

由国家标准化管理委员会组织农业部等相关部门研制的防治禽流感8项国家标准开始正式实施。这8项国家标准分别是：禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法、H5亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法、H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法、H9亚型禽流感病毒荧光RT—PRC检测     

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10~(-5),NA基因检测的灵敏度为10~(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。     

H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用禽流感H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠,再通过抗原抗体反应得到了含有N1亚型的病毒,然后设计针对H5亚型的特异性引物,同时构建含有H5亚型HA基因部分序列的标准质粒,定量后作为模板,建立了可以检测H5亚型禽流感病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法.结果表明,制备的免疫磁珠可以吸附4个血凝单位的H5N1流感病毒和5个血凝单位的H1N1流感病毒,而对H9N2亚型流感病毒无特异性结合,从而可以富集N1亚型的流感病毒.H5亚型RRT-PCR检测灵敏度可达到4.6拷贝/μL,线性范围达5个数量级;特异性强,与NDV和H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应.因此,利用该方法可以很好地检测H5N1禽流感病毒.     

2020—2021年冬春季铜仁市家禽高致病性禽流感专项监测

为掌握铜仁市家禽高致病性禽流感病毒的感染情况,及时研判疫情风险,保障养禽业的健康发展,2020年12月至2021年3月在全市10个县(区)随机选择1个规模场(或种禽场)、1个活禽交易市场(或禽屠宰点),采集咽肛双棉拭子样品和环境拭子样品共计890份,通过实时荧光定量PCR方法检测高致病性禽流感病毒(H5、H7亚型)。结果：13个家禽规模场和9个活禽交易市场全部样品的高致病性禽流感病毒(H5、H7亚型)核酸检测均为阴性。结论：2020—2021年冬春季铜仁市养殖家禽无高致病性禽流感病毒(H5、H7亚型)感染,发生高致病性禽流感疫情的风险较低。     

鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。