辽宁地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解近年来辽宁地区猪瘟流行毒株的遗传变异情况,本试验利用RT-PCR方法对2006年～2011年辽宁地区发病猪群中猪瘟病毒感染情况进行了检测并获得了20株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的扩增片段,测序后得到276 bp的E2基因编码序列;并在此基础上利用DNAStar和MegAlign等软件对所测定的20株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对.结果表明,20株猪瘟野毒株分别属于基因2.1、2.2亚型和1.1亚型,其中基因2.1亚型已经成为辽宁地区猪瘟病毒的优势流行毒株.属于基因2.1亚型的猪瘟野毒株与疫苗株之间的同源性在76.8％～80.5％之间,与经典强毒Shimen株的同源性在77.4％～81.1％之间.而病毒E2基因变异位点主要分布在所测序列的前30个氨基酸,与强毒Shimen株、疫苗株相比其变异率高达20％以上.说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性,并且多数毒株已向远离强毒Shimen株、疫苗株方向变异.     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）扩增并测定了6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C-株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明，6株流行野毒与C-株疫苗毒的核苷酸同源性为82%-84%，流行野毒之间的核苷酸同源性在89%-99%之间，并且明显可分为二个组群，病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C-株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C-株毒对流行野毒的中和滴度。     

猪瘟病毒贵州株E2基因序列分析

为了解猪瘟病毒贵州株GZPD E2基因变异情况,为贵州猪瘟疫苗的选择提供参考依据,试验采用RT-PCR方法对GZPD E2基因进行扩增,并对目的基因进行克隆、测序和序列分析。结果:(1)RT-PCR扩增获得大小为1 343 bp的基因片段,与预期扩增大小相符。(2)目的基因克隆、测序分析显示,GZPD与国内毒株shimen株、C株等在 E2基因上存在较高的同源性,为94.9%～99.9%;与国外毒株GPE、Koslov等的核苷酸同源性为95.1%～95.3%。(3)进化分析显示,GZPD与HuBei、C-ZJ-2008、C-strain、HCLV处于同一进化分支,而与shimen、CSFV-GZ-2009、Koslov、GPE处于不同的进化分支。结果表明:猪瘟病毒贵州株GZPD在 E2基因上存在一定变异,提示贵州猪瘟病毒存在一定的进化。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

咸阳地区猪瘟病毒 E2基因扩增与序列分析

为了解陕西咸阳地区猪瘟流行毒株 E2基因变异情况,采用套式 PCR 方法,扩增了17个流行毒株和2个市售疫苗毒株 E2基因主要抗原区,并进行了序列比对分析。结果表明,17个流行毒株和兔化弱毒株（HCLV）株相比,E2基因主要抗原区核苷酸同源性在79．0％～80．9％,氨基酸同源性在80．0％～84．4％。市售疫苗和 HCLV 株核苷酸同源性为93．4％,氨基酸同源性为90．0％。系统发育树分析发现17个流行毒株同属基因Ⅱ群。流行毒株与 HCLV 相应氨基酸位点相比,总体变异氨基酸位点占26．4％,呈现出典型的变异特征。17个流行毒株在2个氨基酸关键位点出现了705（T→I）、729（L→A）变异现象,可能导致抗原性发生改变。发现 E2蛋白高保守序列 RYLASLH（713～719）变异现象,即 XYSY01株719位发生了 H→R 变异。结果提示,近年陕西咸阳地区猪瘟病毒流行毒株变异较为一致,E2基因核苷酸与编码氨基酸有较明显的变异。     

猪瘟病毒E2基因密码子偏爱性分析

本试验旨在阐明猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)囊膜结构(糖)蛋白E2基因的密码子使用规律,以期为选择高效的表达系统、探索基因功能提供理论依据.本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对CSFV E2基因进行密码子偏爱性分析.结果显示CSFV E2基因的CAI值为0.703,ENC值为53.161,表明E2在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第3位核苷酸尤其偏爱G或C;从与CSFV E2基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有25个、人有25个;CSFV E2基因共有34个稀有密码子,且还有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现.本试验结果表明酵母等真核生物与CSFV E2基因密码子偏爱性较为接近, 可作为其体外表达系统.     

一株猪瘟病毒田间株EO蛋白基因的克隆和序列分析的研究

采用RT-PCR技术，扩增猪瘟病毒田间株XN株的EO蛋白基因，构建EO基因的重组质粒，序列分析表明，该病毒EO蛋白DNA序列与国内几株流行株的同源性高达99％，与CSFV-1、CSFV-2群猪瘟病毒的差异较大，该病毒EO蛋白191-227段DNA和氨基酸序列与国内流行株比较同源性相对较高，而与不同基因群CSFV国外流行株比较时同源性相对较低。     

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法扩增猪脑心肌炎病毒GXLC株的VP1基因,扩增产物克隆入pMD18-T载体后进行测序,对获得的VP1基因序列进行分析。序列分析表明,GXLC株VP1基因长度为831 bp,编码277 aa,含有2个潜在的N-糖基化基序和9个抗原表位。同源性分析表明,GXLC株与国内外其他26个EMCV分离株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之间、氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之间。遗传进化分析表明,基于VP1基因序列绘制的系统进化树可以将所有EMCV分离株分成两个群,即Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源、鼠源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,人源EMCV则分布在Ⅱ群;GXLC株与其他中国分离株均属于Ⅰa亚群。     

猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。