黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达水平

Boule基因是DAZ家族成员之一,在生殖细胞中特异表达是精子发生过程中减数分裂的关键调控因子,其表达缺乏可引起减数分裂阻滞和精子生成障碍,导致雄性不育。为揭示Boule基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系,本研究利用实时荧光定量PCR法,对黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达进行定量分析。结果表明:Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平相对都比较高,黄牛与牦牛差异不显著(P>0.05);而Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平显著高于犏牛,黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P<0.05)。结果提示,Boule基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关,可作为研究犏牛雄性不育的重要候选基因。     

Dazl基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系的研究

本文旨在探讨Dazl基因与犏牛雄性不育的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Dazl基因mRNA表达并进行分析。结果表明:三种牛中Dazl基因在睾丸组织中特异表达,且犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P<0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P>0.05)。结果提示,Dazl基因在三种牛睾丸组织特异表达,说明Dazl基因在细胞周期运行中发挥作用,Dazl基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关。     

GSTM3基因在牦牛和犏牛睾丸及附睾组织中的表达研究

谷胱甘肽S-转移酶Mu 3(GSTM3）是一种必需的抗氧化酶,其在精子中的存在与精子的耐冷性、质量和生育能力有关。为研究GSTM3的表达与雄性牦牛繁殖功能的关系,本研究对牦牛附睾GSTM3基因进行克隆、生物信息学分析,并应用实时荧光定量PCR分析GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中的表达情况。结果表明,牦牛GSTM3基因CDS区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸;GSTM3基因编码蛋白为弱酸性且不具有跨膜结构,分子式为C1204H1857N319O340S19,分子量和等电点分别为26.85 ku和7.29;牦牛GSTM3核苷酸序列与普通牛和瘤牛有较高的种间同源性,分别为99.26%和98.53%;GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中均有不同程度的表达,牦牛附睾和睾丸的GSTM3表达量显著高于犏牛。     

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

miR-383在牦牛、犏牛睾丸组织中的差异表达及功能预测

本研究旨在分析miR-383成熟体在雄性牦牛和犏牛F1代睾丸组织中的差异表达,以了解其在精子形成中的重要作用.以发育成熟的牦牛和犏牛睾丸组织为材料,利用实时荧光定量PCR方法检测miR-383成熟体在牦牛及犏牛睾丸组织中的差异表达情况;利用TargetScan和miRanda数据库获得miR-383的靶基因集合,通过David和Gene Ontology在线软件分析miR-383靶基因的生物学功能.实时荧光定量PCR结果显示miR-383成熟体在牦牛和犏牛F1代睾丸组织中表达显著差异(P<0.05),在牦牛睾丸组织中表达量较高,靶基因预测共获得131个靶基因,GO分析及KEGG信号通路分析得到miR-383靶基因功能,这些靶基因参与了细胞增殖、凋亡、核酸合成调控等过程.结合miR-383成熟体的表达差异和靶基因功能预测结果,miR-383可能参与生殖细胞的分化及精子形成调控,为miR-383在犏牛生殖细胞中的功能与调控机制研究提供了理论依据.     

牦牛FHL2基因的克隆、组织表达与蛋白定位分析

旨在获得牦牛FHL2基因序列,阐明该基因序列、蛋白质结构与性质、mRNA的组织表达模式、在雌性生殖器官及颗粒细胞的蛋白表达特性。本研究以5头健康空怀成年母牦牛的心、肝、脾、肺、肾、卵巢、子宫、输卵管组织及5头妊娠2个月左右母牦牛的子宫、输卵管和卵巢为研究材料,利用逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆FHL2基因,并使用在线分子生物学软件分析其生物信息学特性;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析FHL2基因的组织表达特性;应用免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)技术检测FHL2蛋白在雌性生殖器官的分布和颗粒细胞上的亚细胞定位。结果发现,FHL2基因CDS区全长840 bp (ON456866),编码279个氨基酸,FHL2蛋白属于弱碱性亲水不稳定蛋白,没有跨膜结构。不同物种的FHL2氨基酸序列比对和进化树分析表明,FHL2基因编码区在物种进化中比较保守。RT-qPCR结果显示,FHL2基因在检测的组织都有表达,在心的表达量极显著高于其他检测组织(P<0.01);在肺、卵巢、输卵管和子宫中的表达量极显著高于肝、脾和肾(P<0.01)。FHL2基因在妊娠期子宫中的表达...     

绵羊INSL3基因组织表达规律与潜在功能位点分析研究

旨在对绵羊INSL3基因组织表达规律与潜在功能位点进行分析。本研究首先利用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对健康、角型正常、1岁的小尾寒羊成年母羊和公羊各3只的INSL3组织表达规律进行研究,随后利用10个品种重测序数据分析INSL3基因区域主成分（PCA）和功能位点。定量结果显示,INSL3基因在卵巢和睾丸中表达最高,在软角也表达,公羊睾丸表达量极显著高于母羊卵巢组织（P<0.01）,公羊软角组织表达显著高于母羊（P<0.05）,结合公母羊角的大小差异,说明该基因可能与角有关。PCA结果显示,该区域一定程度上按角的有无进行品种聚类,进一步说明该区域可能与角有关。功能位点分析发现,4个潜在SNPs位点在有角和无角群体中存在显著性差异分布,其中SNP1处于KDM1A转录因子结合位点上,SNP3位于ESR1结合位点,SNP6存在于终止子区域。同时还发现一个错义突变和同义突变。本研究表明,绵羊INSL3基因可能既与公母羊角的差异有关,也可能与绵羊角的有无有关,并找到多个潜在功能位点,为今后研究其功能机制奠定基础。     

牛睾丸差异表达基因Septin10的筛选、鉴定及组织表达研究

本研究旨在筛选出决定或影响公牛睾丸周长(SC)的基因片段,并研究其功能和表达特征,为今后种公牛的选育提供理论基础。用mRNA差异显示技术从睾丸周长极显著差异(P0.01)的睾丸组织中筛选差异表达的基因片段,并用反Northern杂交及荧光定量的方法鉴定筛选的结果,研究筛选出基因的组织表达谱。结果,筛选出1条差异表达片段A71,经测序和BLAST分析发现该片段与牛Septin10基因高度同源(99%),且该基因在肝脏等9个组织中都有表达,在2组睾丸组织中相对表达量差异显著(P0.05)。分析结果表明,Septin10基因是牛睾丸差异表达基因,可作为一个研究牛繁殖性状的候选基因。     

仔猪睾丸组织c-jun mRNA表达量与其血浆睾酮水平关系研究

对不同时期仔猪血浆睾酮含量和睾丸组织c-jun mRNA表达量进行了检测,以初步推测c-jun mRNA表达与睾酮分泌的关系,为进一步体外研究原癌基因c-jun对睾酮分泌的影响奠定基础。试验选择1、3、5周龄仔猪作为研究对象,利用睾酮ELISA检测试剂盒检测血浆中睾酮含量;采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测睾丸组织c-jun mRNA的表达。结果表明,仔猪血浆睾酮水平随周龄增加而显著升高,其中3周龄时睾酮含量最高;c-jun在各周龄睾丸组织中均有表达,其中3周龄仔猪睾丸组织c-jun mRNA表达量最高。因此,仔猪睾酮分泌与c-jun mRNA表达量可能存在相关性。     

Differential Expression and Function Prediction of miR-383 in Yak and Cattle-yak Testis

The aim of this study was to detect the differential expression of miR-383 in yak and cattle-yak testis,and explore the important roles of miR-383 in spermatogenesis.Using the testis tissue of mature yak and cattle-yak as experimental material,Real-time PCR was performed to detect the miR-383 expression.miR-383 targets were obtained using TargetScan and miRanda database,and biological functions of these target genes were predicted by David and Gene Ontology online softwares.The miR-383 had significantly differential expression in F₁ testis tissue between yak and cattle-yak(P<0.05),and it had the highest expression level in yak testis tissues.131 target genes were obtained by target gene prediction which involved in cell proliferation,apoptosis,regulation of nucleic acid synthesis and other processes by GO analysis and KEGG pathway analysis.The results showed that miR-383 might participate in the regulation of germ cell differentiation and spermatogenesis,which would provide clues and theoretical basis for studying the function and regulation mechanism of miR-383 in cattle-yak germ cell.     

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2（establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2）基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组（5~6月龄）、幼年组（1~2岁）和成年组（3~4岁）,每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因（GenBank登录号：MW198470） CDS区为1 833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织（P<0.05）;在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛（P<0.05）;IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。     

犏牛PPP1R11基因的克隆及在睾丸中的表达规律研究

旨在克隆犏牛蛋白磷酸酶1调节亚基11(protein phosphatase 1 regulatory subunit 11,PPP1R11)基因,分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为解析其在雄性生殖中的功能机制提供理论依据.本研究采集成年犏牛睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉和脂肪组织(n=3...     

牦牛和犏牛促卵泡素受体基因5′-侧翼区序列多态性研究

本研究旨在分析牦牛和犏牛促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)基因的多态性,为从遗传角度上解决其繁殖产仔率低的问题提供参考,为筛选繁殖性状分子标记奠定理论基础。研究采用PCRSSCP和直接测序技术,对麦洼牦牛、九龙牦牛、大通牦牛和犏牛共110头个体的FSHR基因5′-侧翼区进行遗传多态性分析,统计基因频率和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态性指标。结果表明,麦洼牦牛、大通牦牛和九龙牦牛FSHR基因5′-侧翼区核苷酸序列具有多态性,犏牛无多态性;麦洼牦牛存在AA、AB和BB 3种基因型,九龙牦牛和大通牦牛均存在AA、AB 2种基因型,AB基因型在3个牦牛品种中占绝对优势,等位基因A为优势等位基因;麦洼牦牛、九龙牦牛和大通牦牛的多态信息含量分别为0.3693、0.3565、0.3705,均达到了中度多态(0.25PIC0.5),表明各牦牛品种遗传变异较大。     

牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT基因CDS序列的比较

褪黑激素（MLT）是调控动物季节性生殖等多种生物节律,具有复杂生理功能的一种吲哚类激素,羟基吲哚-氧-甲基转移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase,HIOMT）是决定MLT合成波动模式的重要酶之一。采用RT-PCR法克隆并分析了牦牛、犏牛和藏黄牛HIOMT基因的CDS序列。牦牛该基因序列连续缺失123bp,通过与普通牛基因组序列比对,该缺失片断位于HIOMT基因7个外显子中的第6外显子。由于克隆所得牦牛基因组DNA相应序列未缺失上述片断,推定所获得的牦牛HIOMT基因CDS序列属可变剪接体;克隆犏牛HIOMT基因获得长、短两条件序列,长序列与藏黄牛、普通牛该序列相似,短序列与牦牛相似,但尚不能确定这两条序列各自来自父本还是母本;与普通牛HIOMT基因比较,牦牛、犏牛和藏黄牛分别有11、13（长序列17）和11个变异位点,且位于密码子第1、2位点的变异分别为4、6（7）和4个,均为非同义突变,所有非同义突变只有1处由密码子第3位变异引起,这些突变可能通过影响蛋白结构进而影响其生物学功能。还预测了牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT蛋白相对分子量、理论等电点、疏水性、跨膜区等。HIOMT的保守性较强,是系统进化研究较理想的分子标记。     

Cloning of L-PGDS Gene and Its Expression Pattern in Different Tissues and Testis at Different Development Stages in Cattle-yak

The purpose of this study was to clone the prostaglandin D synthase (L-PGDS) gene and identify its expression pattern in various tissues and testis at different development stages in cattle-yak,in order to provide experimental basis for studying the mechanism of L-PGDS gene in testis development of cattle-yak.The total RNA of heart,liver,spleen,lung,kidney,large intestine,small intestine,gastric,brain and testis at different development stages (fetal,calve tuberty and old) of healthy cattle-yak were extracted by Trizol method.The L-PGDS gene sequence was amplified and cloned by RT-PCR,and analyzed by related biological software.The expression of L-PGDS gene mRNA in different tissues and testicular tissues at different development period of in cattle-yak were detected by Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of L-PGDS gene was 624 bp,including the ORF of 576 bp,which encoded 191 amino acids.Homology alignment results showed that L-PGDS gene in cattle-yak had high homology with Bos taurus and Ovis aries,which were 99.28% and 94.00%,respectively.Phylogenetic tree results showed that the relation between cattle-yak and Bos taurus was the closest,followed by Ovis aries and Equus caballus.The L-PGDS protein was an unstable hydrophobic protein,the molecular weight was 21.229 ku,the molecular formula was C₉₅₃H₁₄₇₁N₂₅₁O₂₈₁S₉,the isoelectric point was 6.43,and the instability index was 47.25.The L-PGDS protein had no transmembrane region and no signal peptide.The secondary structure of L-PGDS protein contained alpha helix,random coil and extended chain,the rats of them were 25.65%,53.40% and 20.94%,respectively.L-PGDS gene was highly expressed in testis of cattle-yak,which was extremely significantly higher than that in other tissues (P<0.01).The expression of L-PGDS gene mRNA in testis of cattle-yak increased firstly and then decreased along with age,and with the highest expression in puberty stage,which was extremely significantly higher than that at other periods (P<0.01).This study provided basic data for further study on the mechanism of L-PGDS gene in the development of testis in cattle-yak.