利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。     

叶酸生物合成途径中调控基因folB表达载体的构建及在大豆中的转化

叶酸是一种水溶性B族维生素,是维持人体正常活动所必需的营养元素之一,也是植物体内参与一碳单元反应的重要辅酶。folB基因是叶酸调控基因,来源于拟南芥,调控叶酸合成途径中的关键酶DHNA的生成。本研究将人工合成的folB基因转入大豆受体材料Williams82中。共侵染200个大豆外植体,得到26株转化苗。通过对转化苗的草丁膦(浓度150 mg/L)涂抹鉴定,获得16株除草剂抗性转化苗。通过PCR检测,得到12株PCR阳性转化苗。经过bar试纸条检测,其中10株为阳性。Southern杂交结果表明,9株转化苗为Southern杂交阳性。研究结果表明:外源功能基因folB和筛选标记基因bar已经整合到大豆基因组中。相应的转基因后代表现出除草剂抗性和folB基因Southern杂交阳性。本研究通过将folB基因转入大豆,获得了转基因后代,以此为基础可进一步选育高叶酸含量的转基因大豆品种。     

水稻T-DNA插入群体的建立及侧临序列的获得与分析

采用农杆菌介导转化方法,将携带有GUS基因1301质粒转入日本晴水稻品种中,建立水稻T-DNA插入群体5 200个.研究表明:通过PCR和Southern Blot分析证明了再生植株为转基因植株;通过改进热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法,已成功地分离并测定了437个株系的侧翼序列;通过序列同源性分析表明,有1...     

抗病基因PR1在大豆中的遗传转化与多抗材料的培育

单一抗病、抗虫品种在农业生产中已经不能满足需要,本研究通过基因工程技术构建抗病基因pCAMBIA-3301-PR1表达载体,通过花粉管通道法转化外源抗病基因PR1到含有CryAB-13-1转基因高世代受体大豆中,得到兼具抗病抗虫新材料。对T2转基因植株进行常规PCR检测,Southern Blot杂交,Real Time PCR检测,室内、室外抗虫鉴定,室内抗病鉴定。结果表明,在T2代常规PCR检测中,阳性植株共15株。Southern Blot杂交结果显示,PR1与CryAB-13-1基因均以单拷贝子的形式整合在大豆中。Real Time PCR表明PR1和CryAB-13-1基因在不同组织中表达量有差异,PR1基因在植物根、茎、叶中表达量平均分别为2.88、1.48、5.86,CryAB-13-1基因在根、茎、叶中表达量平均分别为3.03、1.32、7.11。室外抗虫鉴定阳性植株CryAB-13-1基因的植株虫食率为3.47%,抗虫级别上属于R-抗,抗虫级别从感虫到抗虫级别。室内采用圆盘分隔法进行抗虫鉴定,转化植株芽长有明显增长。室内抗病鉴定未转化植株平均死亡率高达58.34%,转...     

多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定

 GFP47是一个利用双元载体pPZP111构建的绿色荧光蛋白基因的简单质粒载体pPZP-GFP经农杆菌介导转化陆地棉(Gossypium hirsutum L.)获得的T₀株系,PCR和Southern杂交分析证实其不仅整合了多个拷贝的正常的T-DNA,而且有紧邻T-DNA左边界的载体骨架序列的整合。对来源于GFP47的33个T₁个体的PCR分析表明,T₁后代中可以分离只有正常T-DNA整合的个体。对T₁群体中不同基因型个体的Southern杂交分析结果显示,该多拷贝整合的T₀转化体至少在棉花基因组中有四个插入位点,不同的Southern带型暗示不同插入位点的T-DNA结构和排布有很大的不同。至少有一个位点整合了只包括目的基因和选择标记基因在内的正常T-DNA结构。     

病毒复制酶基因Nib8和ERF转录因子W17基因枪法共转化小麦

将对小麦黄花叶病毒表现高抗的复制酶基因Nib8和具有广谱抗病性的ERF基因W17分别构建到单子叶高效组成型表达载体上,采用基因枪共转化法转化到小麦品种扬麦12和扬麦16中,PCR检测共获得Nib8基因的阳性转基因植株42株,W17基因的阳性转基因植株48株,及两个功能基因均为阳性的转基因植株6株。以扬麦12为受体的转化率分别为1.53%(Nib8)、4.87%(W17)和0.42%(Nib8+W17);以扬麦16为受体的转化率分别为2.05%(Nib8)、0.86%(W17)和0.20%(Nib8+W17)。对两个功能基因都呈阳性的6个植株进行Southern blotting分析,进一步证实功能基因已经整合到小麦基因组中。本研究为获得具有综合抗病性的小麦新材料奠定了基础。     

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从类产碱假单胞菌YSl(Pseudomonas psuedoalcaligenese YSl)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因：phaCl、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对phaCl基因进行了改造，经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaCl)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaCl和phaC2双基因)。将构建好的嵌合phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2，用冻融法转入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHAl05)并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan)。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株，抗性植株大田生长表型正常，生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR-Southern、Southern检测初步确定有32％烟草稳定整合了phaCl和phaC2。用氯仿一次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA，在产物合成水平确证有25．6％的转基因植株。     

甘蓝型油菜CONSTANS基因植物过表达载体构建及转基因植株的获得

甘蓝型油菜CONSTANS目的基因的克隆以NCBI上公布的序列设计全长扩增引物进行扩增。对目的基因片段测序并进行酶切位点分析,设计酶切引物(BamHⅠ,SacⅠ),通过BamHⅠ和SacⅠ双酶切将目的基因片段连接在真核表达载体pBI121上,PCR鉴定结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功构建。将过表达载体转化感受态EHA105细胞,通过拟南芥花絮侵染T0代种子,用含卡拉霉素(50 mg/L)的MS固体培养基进行筛选,获得阳性植株。通过PCR鉴定,结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功导入拟南芥中,获得转基因阳性苗12株,为下一步基因功能分析做好了准备。     

禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T_0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T_1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T_3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T_1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。