用立式多层产孢箱同步生产多株生防真菌孢子粉

利用自主研制的一台立式多层产孢箱作为固相发酵产孢装置，对2株金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、1株金龟子绿僵菌金龟子变种（Manisopliae var．anisopliae）和2株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）同时进行了高纯度孢子粉生产的产能试验。每菌株接种6kg大米基质，等量分置于产孢箱的3层中，于25℃下发酵6d。在5株供试菌中，球孢白僵菌Bb2860菌株的产孢量最高，达到2．2×10^12个孢子/kg大米，表现出优异的工艺性状和商品菌剂开发潜力。     

冬虫夏草子囊孢子萌发及其无性型观察

1995年从云南德钦白马雪山和人支雪山调查收集了新鲜冬虫夏草(Cordyceps sinensis)标本，对其子囊孢子微循环产孢进行了观察，并将其与子囊孢子分离和组织分离菌株的产孢结构进行了比较。结果表明，微循环产孢的产孢结构和分离菌株的产孢结构相似，并与中国被毛孢(Hirsutella sinensis)的产孢结构相似，由此证明冬虫夏草的无性型应是中国被毛孢，中华束丝孢(Synnematium sinensis)为中国被毛孢的同物异名。     

氨基酸维生素对绿僵菌液生分生孢子形成影响

对金龟子绿僵菌在不同氨基酸为氮源、不同维生素为生长辅助因子的液体培养基中菌丝生长和液生分生孢子的形成进行研究 .研究结果表明 :不同氨基酸和维生素对金龟子绿僵菌的生长及液生分生孢子的形成影响极显著 .以天门冬酰胺和 L -丙氨酸为氮源的培养液有利于绿僵菌液生分生孢子的形成 .产孢量达 5.1× 1 0 9和 4.7× 1 0 9个孢子·L-1.在培养液中添加适宜的生长辅助因子能有效刺激液生分生孢子的形成 . VB6+ VH或复合维生素 B能使绿僵菌获得较高的液生分生孢子产量 (产孢量高达 1 7.8× 1 0 9和 1 6.4× 1 0 9个孢子· L-1) .同时 ,试验还显示 :液生分生孢子的产量与培养基氮源的性质有关 ,复杂的氮源比简单的氮源更有利于液生分生孢子的形成     

感染球孢白僵菌的马尾松毛虫僵虫产孢量的测定

实验室使用球孢白僵菌不同菌株感染松毛虫３￣４龄幼虫,得到干虫尸体长、体重及产孢量遵循方程：Ｎ＝１０＾（７．６１００＋０．０１２６ｘ１＋０．００８１ｘ２）。方组回归显著,由不同菌株的测量值,根据公式得到理论值,经卡方检验,各菌株间的产孢量没有显著性差异,林间采回的感病僵虫测量值同样遵循方程。     

液体深层培养贵州绿僵菌分生孢子的研究

本文对贵州绿僵菌液体深层培养的研究表明，不同氮源对生长量、液生芽孢子和液生分生孢子产孢量影响显著．不同碳源对生长量和液生芽孢子产孢量影响显著，但对液生分生孢子产量无明显影响．同时试验还表明，液生分生孢子的形成与培养液的碳氮比、pH以及通气量有关．     

绿僵菌菌株遗传多态性与地理来源及寄主种群分化的关联性

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t鉴定从云南省玉溪市峨山县塔甸镇玉米田自然罹病蛴螬分离培养获得的绿僵菌Ma130821种类,明确该菌株在害虫生防制剂开发应用的潜力。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t根据微生物菌落培养特征和产孢结构特征,结合ITS-5.8S DNA序列,对绿僵菌Ma130821进行种类鉴定,同时对其产孢特性进行研究。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t绿僵菌Ma130821为黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride),该菌株Ma130821在大米、麦麸、玉米粒和稻壳基质上固相培养后均能生长和产孢,但产孢量不同。其中在大米基质上,黄绿绿僵菌的每克孢子含孢量和每克基质产孢数均为最高,同时所产孢子萌发率极显著高于其他培养基所产孢子(P<0.01),由此以大米为基质,系统研究了黄绿绿僵菌Ma130821菌株的产孢特性。发现在25 ℃条件下,黄绿绿僵菌在大米基质上每克孢子含孢量最高达到1.47×10⁹个,极显著高于28 ℃和30 ℃ (P<0.01),所产孢子在48 h时的萌发率达到100%;16L∶8 D光照条件下每克孢子粉产孢量高达5.07×10⁸个,极显著高于14 L∶10 D光照条件下的产孢量,在第48 小时时,16 L∶8 D条件下所产孢子的萌发率达到100%。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t从云南省玉溪市峨山县塔甸镇玉米田自然罹病蛴螬分离培养获得绿僵菌Ma130821为黄绿绿僵菌(M. flavoviride)。以大米为固相产孢基质,在25 ℃、16 L∶8 D的培养条件下最适宜该菌株分生孢子扩大培养。\t\t\t\t\t\t\t\t\t     

不同来源金龟子绿僵菌菌株生物学特性

选择不同地理、寄主来源的15株金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株,对各菌株菌落形态、生长速度、产孢量等生物学性状进行比较。结果表明:(1)根据菌丝质地和颜色、产孢能力、孢子颜色等将15株菌株分为6类,其中A、B、C类菌株分别有3、3、6株,D、E、F各有1株。(2)不同金龟子绿僵菌菌株的生长速度在初期(10 d以内)差异显著,Ma QZ-01、Ma JGZ-01和Ma FZ-04菌株10 d时菌落直径均超过6 cm,显著快于其他菌株;到生长后期(15 d),由于进入了产孢阶段,除Ma-20、Ma JGSTR-01菌落直径较小外,其他菌株差异不显著。(3)不同菌株产孢量差异显著,Ma QZ-01、Ma ZPTR-04和Ma SHTR-05菌株产孢量显著高于其他菌株,分别达到0.147×109、0.145×109和0.137×109个·cm-2。综合生长速度与产孢量两项指标,Ma QZ-01菌株具备生长迅速、产孢量大等优良生产性能,可作为优良菌株进一步在害虫防治中加以利用。     

莱氏绿僵菌Nr0815分生孢子在化学农药中的相容性

为明确莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子在常见化学农药中的相容性,室内观察了2种除草剂(68%草甘膦铵盐可溶粒剂、200 g/L百草枯水剂)、3种杀菌剂(75%百菌清可湿性粉剂、80%多菌灵可湿性粉剂、65%代森锌可湿性粉剂)和2种杀虫剂(24%灭多威可溶液剂、20%甲氰菊酯乳油)对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发、菌丝生长和产孢量的影响。结果表明,7种化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发、菌丝生长和产孢量均具有一定的抑制作用,抑制效果表现为杀菌剂杀虫剂除草剂。其中,除草剂以68%草甘膦铵盐可溶粒剂对分生孢子萌发率、菌丝生长抑制率和产孢量的影响最小,在最大推荐使用质量浓度(8 000μg/mL)下,72 h时的孢子萌发率、菌丝生长抑制率和产孢量分别为(22.00±3.40)%、(72.79±2.49)%、(4.93±0.44)×10~8个/mL。除草剂杀菌剂杀虫剂中,莱氏绿僵菌菌株Nr0815分别与68%草甘膦铵盐可溶粒剂、80%多菌灵可湿性粉剂和20%甲氰菊脂乳油的相容性较好。     

蓝光促进绿僵菌产孢和产孢调节基因fluG表达

【目的】明确蓝光照射对绿僵菌产孢的促进作用及与产孢调节基因fluG表达量的关系,为绿僵菌发酵生产提供光照促进产孢的理论依据和技术参数。【方法】以绿僵菌高效杀虫菌株M202为试材,平板接种培养,通过显微观察每隔12 h的菌体发育状态,确定菌株发育进程产孢前期、初始期、旺盛期、平稳期的对应时段。以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理在黑暗中培养至不同发育期即24、48、72 h的菌体,继续培养到产孢稳定期后,采用打孔法取样,以显微计数法检测计算产孢量,评估菌体发育阶段对蓝光的敏感性以及蓝光照射能量对产孢量的影响。克隆fluG,建立fluG real-time PCR反应体系;以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理发育至48 h即处于产孢前将进入产孢期的菌丝体,照射处理后立即取菌丝,液氮冷冻,提取RNA并反转录成cDNA,通过real-time PCR检测fluG表达量,评估蓝光照射对fluG表达量的影响。【结果】绿僵菌M202菌株发育24 h前为萌发期,24-72 h为菌丝快速生长期,其中48 h还处于产孢前期,60 h已进入产孢初期,72-96 h为产孢盛期,96-120 h为产孢末期,120 h后为孢子成熟期,7-10 d后产量达到稳定。蓝光不同能量照射24 h菌龄即初期菌丝体,其产孢量与无光照处理的对照无显著差异,照射48 h菌龄即菌丝快速生长的产孢前期,其产孢量显著提高,最适照射能量为20 412-40 824 J?m^-2,其中34 020 J?m^-2使产孢量最高达无光照处理对照的1.50倍,72 h菌龄即产孢结构形成、产孢量快速增长期对蓝光最为敏感,低至6 804 J?m^-2的照射能量即可显著提高产孢量,且宽泛的各剂量均有效。对于fluG的表达,在试验照射剂量范围内,48 h菌龄接受蓝光照射后,fluG表达量显著提高,表达量随照射剂量呈先上升后下降的趋势,在20 412 J?m^-2以下较低能量时,fluG表达量与照射剂量成正相关,当照射时间为2.25 h时,表达量达到最高,为无光照处理对照的2.41倍,而在20 412 J?m^-2以上较高能量时,二者呈现负相关,随着蓝光照射时间的增加,基因表达量呈下降趋势;灰色关联度分析显示,当关联因子为0.5时,产孢量与fluG表达量的关联度r值为0.74。【结论】蓝光照射能够促进绿僵菌产孢及fluG表达,不同发育阶段的菌体对蓝光感应有显著差异,在48-72 h菌龄时照射34 020 J?m^-2能量可获得最高产孢量,产孢与fluG之间有较高关联度说明fluG参与绿僵菌产孢的调控。     

2种杀菌剂对金龟子绿僵菌产孢的影响

在 0 .0 5 %～ 0 .1 5 %浓度范围内 ,2种杀菌剂 ( 30 %氧氯化铜和耐克铜 )对金龟子绿僵菌的菌落形成没有明显影响 .而耐克铜在 0 .0 5 %～ 0 .1 5 %浓度时能显著地增加金龟子绿僵菌的产孢量 ,并有缩短产孢时间的作用 .研究还表明 2种杀菌剂对杂菌 (根霉、曲霉和青霉 )有较强的抑制作用 ,并随着浓度的增大 ,抑制作用迅速增强 .试验结果对绿僵菌菌剂生产具有重要意义     

培养基和土壤中木霉菌与绿僵菌微生态关系

为研究木霉菌与绿僵菌在平板及土壤中相互关系,以不同配比同时接种2株菌,采用平板对峙和土壤再分离试验,观察2种菌株生长过程相互作用。采用先接种绿僵菌,间隔不同时间后接种木霉菌,观察2种菌株生长及相互影响。结果表明:2种菌株同时接种时,木霉菌与绿僵菌比例1:100时,平板上木霉菌平均生长距离是绿僵菌的6倍,土壤中培养4d后绿僵菌难以从木霉菌中分离得到,木霉菌对绿僵菌生长具有极显著的抑制作用,木霉菌生长处于优势,绿僵菌生长受抑制。先接种绿僵菌,7d后接种木霉菌,当2种菌株生长处于稳定后,平板上绿僵菌生长距离略低于木霉菌生长距离1mm,土壤中绿僵菌孢子量高于木霉菌,木霉菌的生长优势减弱,绿僵菌生长速率提高,二者生长趋于平衡,可实现一定水平的共存。因此,需要深入研究木霉菌和绿僵菌在土壤中复杂的微生态关系,寻找避免两者直接生态竞争的关键技术,才能实现2种菌剂的协同使用。     

不同菌株绿僵菌酯酶型与其致病力的关系

对17株绿僵菌的酯酶同工酶培养特性和毒力进行了比较研究。结果表明:不同菌株酯酶同工酶型不同,绿僵菌的毒力与酶型及菌株培养特性有一定相关性。同工酶型可作为毒力筛选和鉴定绿僵菌种的标志。     

化学杀虫剂对绿僵菌胞外蛋白酶和几丁质酶活性的影响

研究了几种化学杀虫剂对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)胞外蛋白酶和几丁质酶活性的影响。结果表明,化学杀虫剂对绿僵菌的胞外蛋白酶和几丁质酶活性影响较大,供试的12株金龟子绿僵菌大部分菌株的胞外蛋白酶和几丁质酶活性均明显降低,仅有Ma202、Ma207菌株的胞外蛋白酶和几丁质酶活性略有提高。     

椰心叶甲高毒力绿僵菌菌株筛选及分子鉴定

为获得高毒力绿僵菌菌株用于防治棕榈科植物害虫椰心叶甲的菌剂,从椰心叶甲为害严重的地区采集椰心叶甲僵虫,分离到16株疑似绿僵菌菌株。测定上述菌株对椰心叶甲成虫和四龄幼虫的致病力,从中筛选2株毒力较高的菌株CM1601和HK1304。CM1601对成虫和四龄幼虫的LT50分别为4.1、3.9 d,HK1304为4.4、4.2 d。经进一步毒力试验发现,菌株CM1601和HK1304对椰心叶甲的毒性随着孢子浓度的增加而上升,当浓度分别上升到1.0×10~8、2.5×10~8孢子/mL时,菌株对椰心叶甲致病力达到峰值。通过对菌株CM1601和HK1304的ITS序列及系统发育树分析,鉴定两菌株分别为金龟子绿僵菌和金龟子绿僵菌蝗变种。研究筛选得到的高致病力绿僵菌菌株为椰心叶甲的生物防治提供了基础材料。     

绿僵菌菌株的分离及对椰心叶甲的毒力测定

采用土壤分离法和僵虫分离法,获得12株不同来源的绿僵菌。通过对这12株绿僵菌采用2级筛选法进行室内毒力测定,最终确定LA3菌株对椰心叶甲的毒力相对最高,为防治椰心叶甲的优势种。     

土壤中金龟子绿僵菌菌落宏观特征与DNA多态性的RAPD分析

为了解不同地区土壤中金龟子绿僵菌菌株间的亲缘关系,以及不同菌株亲缘关系的远近与菌株的菌落形态和地理来源是否存在相关关系,对分离自河北省8个地区土壤中的12株金龟子绿僵菌进行形态观察及DNA多态性的RAPD分析.结果表明,不同地理来源菌株间的菌落形态和DNA图谱均存在明显差异;依据菌落孢子的分布形态、基质色泽、孢子颜色以及珠状渗出液的有无等特征能实现与RAPD聚类结果相同的菌株类型划分结果,证实了利用菌株培养特征对菌株亲缘关系远近进行类型划分的可行性;同时,RAPD聚类结果也表明菌株问差异与地理来源有一定的相关性.     

微小牛蜱饱血雌蜱高毒力绿僵菌菌株的筛选及应用

为筛选微小牛蜱的高毒力菌株,采用浸渍法测定了8株绿僵菌对微小牛蜱饱血雌蜱的存活指数.结果显示,菌株MaAT.4对微小牛蜱饱血雌蜱的毒力最强,其孢子悬浮液推荐杀蜱浓度为1×10~8个·mL~(-1).     

绿僵菌酯酶同工酶的研究

对１８株绿僵菌以及绿僵菌不工的酯酶同酶进行了比较研究。结果表明,不同菌株的酶谱类型存在着明显差异,同一菌株不同世代间酶谱类型虽未变化,但其酶活性随着继代数的增加而降低,而且酶型以及酶活性的变化与菌株的毒力,亲缘关系以及其他生物学特征存在着一定的相关性。因此,酯酶同工酶可以作为绿僵菌毒力筛选和菌各鉴定的一种参考指标。     

台湾黑僵菌防治海榄雌瘤斑螟的菌株筛选

应用9株台湾黑僵菌菌株,筛选出对海榄雌瘤斑螟(Acrobasis sp.)具有高效防治的菌株,并开展林间应用研究。结果表明:在使用浓度为1×108孢子·m L-1的条件下,不同黑僵菌菌株对海榄雌瘤斑螟幼虫具有显著不同的致病力,其中黑僵菌F061菌株的致病力最强,在12 d的累积死亡率达98.75%,校正死亡率达97.56%±1.24%,均极显著的高于其他处理组(P<0.01),且对海榄雌瘤斑螟幼虫的致死中时最短,为7.25 d。在林间应用中,以1×109孢子·m L-1和2×109孢子·m L-1黑僵菌F061菌株处理对海榄雌瘤斑螟的防治效果最好,分别达到90.03%±1.74%和90.55%±1.21%,均极显著的高于其他处理(P<0.01)。从海榄雌瘤斑螟的防治效果结和应用成本考虑,选取1×109孢子·m L-1黑僵菌F061菌株可达到较好的防控效果。