猪Ghrelin基因表达质粒构建及其促生长作用

通过RT-PCR获得猪Ghlelin基因cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )质粒中构建真核表达质粒pcDNA-pGhl,并将该质粒注射到大鼠和新西兰兔后腿肌肉中,以研究pGhlelin真核表达质粒对动物生长和血液相关激素分泌的影响。大鼠试验表明:pcDNA-pGhl在注射初期的1个月内有增加大鼠体重及在整个试验期有降低料重比的趋势。在注射质粒后第6天,试验组个体增重提高10.6%,差异显著;饲料转化率提高10%,差异极显著。新西兰兔试验表明:试验组血液GH水平一直高于对照组,且在注射后2周高出35%,同时随着GH浓度的增加,血液中SS的浓度相应升高。注射重组质粒pcDNA-sGhl有增加血浆GH和SS水平趋势。以上结果表明,Ghrelin基因真核表达质粒通过促进GH的分泌促进生长,但其促生长效能较短暂,可能是由于同时促进生长抑素分泌。     

猪Ghrelin基因真核表达重组质粒的构建及免疫小鼠试验

从猪胃组织中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,经扩增得到450 bp Ghrelin基因。将其克隆到pMD18-T中,经双酶切初步鉴定后,将酶切下的目的基因进一步克隆到真核表达载体PCI中,经PCR、酶切及序列鉴定,证实插入载体PCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列,真核表达重组质粒PCI-Ghrelin-28aa构建成功;以构建的PCI-Ghrelin-28aa质粒肌肉注射(1 mg/kg)昆明小鼠(体重18~20 g),观察其体重变化。结果表明:注射该基因质粒5 d后,实验组小鼠平均日增重高于对照组,且差异显著(P<0.05),尤其是注射10~15 d增重最为明显。本试验构建的PCI-Ghrelin-28aa基因质粒对小鼠具有明显的促生长作用,并将成为新的促猪生长的基因药物。     

营养条件对大鼠胃及小肠内Ghrelin表达的影响

【目的】探讨营养水平对胃肠道Ghrelin表达的影响。【方法】运用免疫组织化学SP法,在高、低和标准3个不同营养条件下,对健康成年雄性SD大鼠胃肠道内Ghrelin阳性细胞的分布和数量变化进行研究。【结果】Ghrelin阳性细胞在大鼠胃及小肠内均有表达,各营养组胃中Ghrelin阳性细胞数量均明显多于十二指肠、空肠和回肠,且主要分布于胃底腺的体部和底部;低营养条件下,Ghrelin阳性细胞表达量较标准营养条件下多(P0.05),恢复到标准状态下后其表达量减少(P0.01);高营养条件下,Ghrelin阳性细胞数量与标准组无明显差异,当其恢复到标准营养条件下时,Ghrelin阳性细胞表达量减少,但单细胞着色面积增大,颜色加深。【结论】营养条件可影响胃肠道内Ghrelin的分泌,并可能通过胃肠道内Ghrelin的分泌间接调节胃肠功能。     

Ghrelin对雌性大鼠促性腺激素分泌及其mRNA表达的影响

【目的】探明Ghrelin在中枢水平上对雌性大鼠促性腺激素分泌及其mRNA表达的影响。【方法】用1 nmol Ghrelin对不同发情周期(发情前期、发情期、发情后期、间情期)雌性大鼠及用不同剂量(0.3,1和3 nmol)Gh-relin对发情后期雌性大鼠分别进行侧脑室注射,15 min后断头采血,离心血清,同时采集脑垂体,采用酶免法测定血清促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)的质量浓度,用实时荧光定量PCR法检测LH mRNA、FSH mRNA在垂体中的表达。【结果】①在发情前期和间情期,Ghrelin可显著抑制雌性大鼠LH的分泌和LH mRNA的表达(P0.05);Ghre-lin对整个发情周期中FSH的分泌不产生影响,仅在发情期抑制FSH mRNA的表达(P0.05)。②在发情后期,0.3和1 nmol的Ghrelin对大鼠促性腺激素分泌和mRNA表达均无影响,但3 nmol的Ghrelin可显著抑制LH、FSH的分泌和LH mRNA的表达(P0.05)。【结论】Ghrelin在中枢水平上对FSH、LH的释放及FSH mRNA和LH mR-NA的表达均有抑制作用,但存在一定的剂量差异,并受发情周期的调节。     

Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。     

pGRF基因质粒对猪生长性能及血液指标的影响

研究猪生长激素释放因子(pGRF)基因质粒对猪生长性能和血液指标的影响,选用24头大白×长白二元杂交去势公猪(平均体质量17.25±0.62 kg),随机分为4个处理,每处理6个重复,分别经臀部注射0、4、6和8 mg的pGRF基因质粒.结果表明:pGRF基因质粒对猪不同生长阶段的影响不同,注射pGRF基因质粒后1～8周效果好于9～15周且促生长效果与剂量有关.整个试验期以6 mg效果最佳,日增体质量(ADG)和耗料增重比(F/G)较对照组分别提高8.02%(P<0.05)和降低7.64%(P<0.05).注射4和6 mg pGRF基因质粒能显著提高猪血液中生长激素的浓度(P<0.05).在注射pGRF基因质粒105 d后,血液中血糖、血清尿素氮和甘油三酯与对照组无显著差异.     

导入外源GRF基因质粒对犊牛生长性能的影响

为了研究导入GRF基因质粒对犊牛生长性能的影响,选取36头体重为约102kg西门塔尔杂交牛,随机分成四组每组9头,分别注射含有0mg,3.37mg,6.74mg,10.11mg质粒的5ml生理盐水。在试验过程中,定期进行增重,饲料采食量和生长激素水平的测定。试验结果表明,各处理组均在一定程度上提高了动物的日增重和饲料转化率,其中6.74mg处理组效果最好,日增重比对照组高出17.33%(P<0.01),饲料转化率提高18.05%(P<0.01)。屠宰后进行组织质粒残留检测,未发现有残留。     

新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。     

旋毛虫ES抗原结构基因TSPGⅡ重组表达质粒构建

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ,从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定,同时表达载体也用相同的酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组子,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ．     

蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达

通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。     

Nesfatin-1及其mRNA在大鼠生长轴中的表达

【目的】探讨Nesfatin-1在大鼠生长轴(下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、肌肉)中的定位及其mRNA的表达情况。【方法】对雌性大鼠进行深度麻醉灌注后,采集下丘脑、腺垂体、肝脏、胰腺、腓肠肌肌肉组织,放入4%多聚甲醛溶液中固定,采用免疫组化PV-9000二步法、DAB显色技术检测Nesfatin-1在生长轴上的分布,另取雌性大鼠断头处死,取相同组织用荧光定量PCR方法检测其中Nesfatin-1mRNA的表达情况。【结果】Nesfatin-1主要分布于下丘脑的室旁核、背内侧核、室周核、外侧区、弓状核、视上核、腺垂体、胰腺的胰岛和腺泡及肝脏与肌肉中。平均光密度分析显示,Nesfatin-1在室周核和胰岛的表达量显著地高于其他组织(P0.05),在胰腺腺泡、肝脏及肌肉中的表达量则显著地低于其他组织(P0.05),在下丘脑背内侧核、外侧区和室旁核中的表达量显著高于视上核、弓状核和腺垂体(P0.05)。Nesfatin-1mRNA在胰腺中表达量最高,腺垂体次之,下丘脑和肝脏较低,在胰腺和腺垂体的表达量显著高于下丘脑和肝脏,但下丘脑与肝脏差异不显著(P0.05);在腓肠肌中未检测出Nesfatin-1mRNA的表达。【结论】Nesfatin-1及其mRNA在生长轴中的广泛表达,表明Nesfatin-1可能对大鼠生长发育具有调控作用。     

纳豆芽孢杆菌的制备及其对番鸭生产性能的影响

采用液态发酵法和固态发酵法制备纳豆芽孢杆菌,并研究日粮中添加不同浓度纳豆芽孢杆菌制剂对番鸭生产性能的影响.结果表明:采用周态发酵法制备纳豆芽孢杆菌优于液态发酵法;在番鸭基础日粮中添加0.2％和0.4％纳豆芽孢杆菌制剂可显著提高番鸭日增重(P＜0.05)、采食量(P＜0.05)和饲料转化率(P＜0.01),以添加0.4％纳豆芽孢杆菌制剂的效果最佳.而日粮中添加0.1％纳豆芽孢杆菌制剂对番鸭日增重、采食量和饲料转化率的作用均不显著(P＞0.05).     

胎盘生长因子在结核性胸腔积液中的表达及其与治疗效果的关系

目的 探讨胎盘生长因子(P1GF)在结核性胸腔积液中的表达及其与治疗效果的关系.方法 检测56例结核性胸膜炎合并胸腔积液患者血清和胸腔积液中P1GF的表达水平,根据胸部CT检查结果将患者分为胸膜增厚组17例和未增厚组39例,分析胸腔积液中PIGF含量与胸膜增厚、胸水吸收时间及患者一般资料的关系.结果 胸膜增厚组胸腔积液中P1GF水平为(1114.59±120.69) ng/L,明显高于胸膜未增厚组的(878.61±116.57) ng/L,差异有统计学意义(P＜0.01),根据积液吸收时间将患者分为3组:胸水吸收时间＜2周18例,2～4周30例,＞4周8例,P1GF水平分另别为(945.56±92.46)、(1080±152.43)、(1138±218.38) ng/L,3组比较差异有统计学意义(P＜0.01),胸腔积液中P1GF表达水平与患者胸水总蛋白量呈正相关(r=0.269,P＜0.05).结论 在结核性胸腔积液患者的P1GF表达水平与胸膜增厚、胸水吸收时间及胸水总蛋白量关系密切,机制可能是P1GF通过刺激胸膜血管生成和渗透性增加而促进结核性胸膜炎病情的进展.     

猪γ干扰素基因真核重组表达质粒的构建及活性测定

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.     

莫桑比克罗非鱼ghrelin 受体基因的特性及ghrelin受体和ghrelin mRNA组织表达

[目的]了解莫桑比克罗非鱼ghrelin/GHSR系统的生理功能。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离莫桑比克罗非鱼2个GH-SR全长cDNA序列,并用荧光定量PCR方法检测了莫桑比克罗非鱼ghrelin基因及其受体GHSR-1a mRNA水平的组织表达,以及饥饿对这2个基因表达的影响。[结果]获得了莫桑比克罗非鱼2个GHSR cDNA全序列（GHSR-1a、GHSR-1b）。GHSR-1a序列全长1 627bp,编码384个氨基酸,具有7个跨膜结构域结构;GHSR-1b序列全长1 858 bp,编码298个氨基酸,只具有前5个TM,在第6个TM的第4个氨基酸处开始缺失。正常生理条件下,2基因在所检测组织中均有表达,但存在明显的组织差异。ghrelin主要由胃中分泌,除性腺外,雌鱼所有被检测组织的表达量均高于雄鱼的表达量,以肌肉中ghrelin基因的表达差异最大,雌鱼是雄鱼的30.4倍。莫桑比克罗非鱼GHSR-1a基因在垂体、肝脏、心脏中表达量较高,且被检测组织中雄鱼的表达量均高于雌鱼的表达量,其中鳃组织的表达差异最大,雄鱼是雌鱼的36.3倍。饥饿28 d后莫桑比克罗非鱼胃中ghrelin基因表达增加,雄鱼ghrelin基因分泌量增加了3.7倍,雌鱼增加了2.6倍;雌雄个体垂体中GHSR-1a的分泌量均略有下降。[结论]ghrelin/GHSR-1a系统可能具有调节莫桑比克罗非鱼能量平衡的作用。     

周期操作对重组大肠杆菌高密度发酵表达类人胶原蛋白的影响

采用补料一分批式发酵,研究了4种不同间歇周期补氮操作对细胞生长和类人胶原蛋白表达的影响,以及发酵过程中细胞质粒稳定性、细胞菌落形成能力和乙酸生成量的变化。结果表明,在每隔10min连续补加 36mL补料氮溶液(22s完成补加操作)的周期操作下,细胞质粒稳定性明显提高,细胞菌落形成能力下降较小,乙酸生成量低,仅0．7 g／L,最终细胞密度为84 g／L,类人胶原蛋白表达量可达到14 g／L,在4种操作方式中最高。     

重组质粒pDsRed1-C1-PinX1的建立及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的构建PinX1真核表达载体,观察PinX1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和增殖的影响。方法重组质粒转染MCF-7细胞并筛选稳定表达系;用Real-timePCR检测PinX1基因mRNA的表达;MTT法检测转染前后细胞生长变化;平板克隆形成试验检测PinX1对MCF-7集落形成能力的影响。结果构建了真核表达载体PDsRed1-C1-PinX1的稳定表达系;转染后乳腺癌MCF-7细胞生长明显减缓,集落形成能力降低。结论 PinX1基因可抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长和增殖。     

品种与日龄对断奶羔羊生长性能及主要消化器官质量的影响

【目的】研究品种及日龄对绵羊断奶羔羊生长性能及其主要消化器官质量的影响,为我国地方绵羊品种资源的利用和肥羔肉的生产提供指导。【方法】选择健康无病、60日龄断奶的小尾寒羊、滩羊、蒙古羊各40只,分别在80,120,160和200日龄,各品种随机选择10只羔羊屠宰,测定其生长性能、平均日增质量和相对生长速率,并测定胃、胰腺、肝脏和小肠的质量。【结果】绵羊品种与日龄对羔羊体质量、平均日增质量和相对生长速率均有显著影响(P<0.05)。各品种羔羊体质量在80与120日龄间差异不明显(P>0.05),在120与160日龄间差异显著(P<0.05),在160与200日龄间,小尾寒羊和蒙古羊体质量差异显著(P<0.05),而滩羊则不显著(P>0.05)。3个绵羊品种相比,小尾寒羊的平均日增质量和相对生长速率均最高,蒙古羊的均最低。日龄对各绵羊品种胃、肝、小肠质量增加影响显著(P<0.05),而对胰腺质量增加影响不显著(P>0.05)。【结论】120~160日龄是断奶羔羊快速生长阶段;小尾寒羊的生长性能优于滩羊和蒙古羊,宜作为肥羔生产的良种母本推广;羔羊胰腺的发育要早于胃、肝和小肠。     

快速鉴定阳性重组质粒方法的改进试验

利用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)直接裂解细菌菌液,通过电泳与空质粒DNA载体进行比较,探讨了一种快速鉴定重组质粒的简单方法。该方法在细菌菌落快速裂解法的基础上进行了改进,既保留了细菌菌落快速裂解法简单方便、成本低廉的优点,同时又克服了细菌菌落裂解法因菌落大小有限以及裂解液粘度大、易于被带出点样孔,致使有时产生假阴性现象的不足,利用该方法鉴定cDNA文库质量时,可以克服菌落较小的限制。     

商品猪胴体性能肉质性状及其随体重变化规律研究

通过测定31头杂交商品猪的胴体品质和肉质特性,以分析商品猪胴体、肌肉品质随体重（92．0～95．0、95．5～98．0、99．0～101．5、107．0～109．0kg）的变化规律,为确定适宜上市屠宰体重提供依据。结果表明,商品猪在92—95kg阶段屠宰瘦肉率最高为61．17％,分别比其它3组提高4．83％（P〉0．05）、11．83％（P〈0．05）和8．84％（P〈0．05）。在107～109kg阶段屠宰肉品质优良,肌肉pH值6．07．肉色和大理石纹评分分别为3．13和3．33,肌内脂肪含量较高为3．89％,肌肉失水率较低为18．91％。在92～109kg阶段,除胴体直长、瘦肉率与体重之间呈显著的回归关系外,其它各项指标与体重间的线性相关不明显。综合分析可知,注重产肉量强调胴体瘦肉率时可选择在92～95kg阶段屠宰;注重肉品质时可选择107～109kg阶段屠宰;若二者兼顾则选择95～98kg阶段屠宰较为合适。