奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。     

广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡白细胞介素2基因序列设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡的外周血淋巴细胞RNA中扩增,均得到大小为470 bp的特异性片断。将10个品种鸡的RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒,经PCR和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定鸡白细胞介素2基因序列。序列分析结果表明:广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因都编码143个氨基酸的成熟蛋白,分子量约为16.3 ku,与哺乳动物和其他品种鸡核苷酸序列的同源性分别为24.8%-30.3%、98.8%-99.8%,氨基酸的同源性为14.6%-16.7%、96.5%-98.6%。     

牛白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,主要由激活的T淋巴细胞产生,它能提高免疫细胞杀伤癌细胞、病毒或细菌感染细胞以及促进抗体生成和分泌的能力[1-2],在机体正常免疫过程中起着十分重要的作用.     

荣昌猪白细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据GenBank收录的猪白细胞介素-6(PIL-6)设计1对特异性引物,经刀豆蛋白素A(ConA)诱导猪淋巴细胞并提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上,经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明:该基因cDNA全长741 bp,开放阅读框由639个核苷酸组成,推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现:荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高,为99.8%~100%,氨基酸的同源性为99.5%~100%。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。     

猪白细胞介素-10的分子克隆与序列测定

从LPS活化的猪外周血单个核细胞（PBMC）提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出猪白细胞介素-10（IL-10）的编码基因，将其连接到pUC18质粒上，然后进行BamHI和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆，序列分析结果表明该基因开放阅读框由528个核苷酸组成，推测产生的编码产物由175个氨基酸组成。猪IL-10基因与人、大鼠和小鼠基因序列的同源性分别为84%、79%和795，与国外报道的猪IL-10基因序列完全一致，试验成功克隆到了猪IL-10基因。     

成华猪淋巴细胞白细胞介素—4基因的克隆及序列分析

将猪外周淋巴细胞进行体外培养，在伴刀豆球蛋白A（ConA）的刺激下培养48h，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT－PCR扩增猪淋巴细胞白细胞介素－4（IL－4）基因，并克隆到pMD-T载体测序。测序结果表明，IL－4基因的cDNA长度为413bp，开放阅读框为402bp，编码134个氨基酸，分子量15.0ku，等电点8．24；与人和小鼠的IL－4基因编码的氨基酸序列的同源性分别为60％和42％。     

绵羊白细胞介素2基因的克隆与表达载体构建

从绵羊血中分离白细胞,提取绵羊白细胞RNA,利用RT-PCR、PCR扩增绵羊白细胞介素2(OvineIL-2)基因。将OvineIL-2PCR产物与TE载体定向连接,用SaLI和BamHI双酶切重组TE,利用低溶点胶回收500bp大小的片段;将其补平后与PPSD质粒连接,用EcoRI酶切鉴定,找出正向连接重组质粒。用BamHI酶切重组PPSD质粒,低熔点胶回收2500bp大小的片段;将其与经BamHI酶切去磷酸化的PME290表达质粒连接,筛选出阳性重组PME290,即为OvineIL-2基因表达载体。     

犬和北极狐白细胞介素-2基因的克隆及序列分析

为了给制备犬和狐白细胞介素-2相关免疫治疗剂、免疫增强剂提供材料,并且为构建插入犬和狐白细胞介素-2基因表达盒的新型基因工程疫苗提供物质基础,从犬、北极狐两种犬科动物基因组中克隆白细胞介素-2,经测序验证扩增片断长度为580 bp,包含全部编码序列和两侧非翻译区。序列分析表明犬与狐核苷酸序列同源性都超过99%,氨基酸序列完全一致。     

蒙古绵羊Bcl-2基因cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊bcl-2基因全序列,根据Gen Bank上已公布的牛的序列,设计了3条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA,采用RT-PCR,技术扩增出bcl-2的c DNA,并重组到p Blueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定,证实所克隆的c DNA为bcl-2,因为该c DNA包含由687个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码229个氨基酸。经比对,与牛的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.5%和93.4%。     

鸡IL-2基因的克隆及序列测定

应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，参照Ｓｕｎｄｉｃｋ发表的鸡白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ基因序列，利用在行设计合成的１对引物，从ＣｏｎＡ活化的５周龄ＨＷＬ－ＳＰＦ鸡脾细胞中，扩增出长４４５ｂｐ的鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因，以ＰＵＣ１１９为载体，克隆了扩增片段，经酶切鉴定及ＤＮＡ序列测定，确认为鸡ＩＬ－２基因，该序列与Ｓｕｎｄｉｃｋ报道的结果一致。对氨基酸的比较发现，鸡ＩＬ－２与牛ＩＬ－２     

貉IL-2基因的克隆与进化关系的分析

根据GenBank上已发表的犬科动物的白细胞介素-2（IL-2）基因序列，在开放阅读框架上下游的保守区域设计了1对引物。无菌采取貉血，使用淋巴细胞分离液分离外周血液中的淋巴细胞，加入ConA，于二氧化碳培养箱中培养48h后收集培养细胞。以培养细胞中提取的总RNA为模板，应用RT—PCR方法，扩增出貉的IL-2基因。分离纯化片段，连接T载体转化大肠杆菌并测序。结果表明：IL-2基因开放阅读框架全长486bp，编码155个氨基酸。该序列与大、狐等犬科动物的IL-2基因同源关系最近，与大熊猫、家猫的IL-2基因同源关系相对较近，与人、马、牛、绵羊的IL-2基因有一定的遗传距离，与禽类鸡的IL-2基因同源关系最远。     

番鸭细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考GenBank发表的MDPVFM株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出MDPVS1株NS2基因,目的片段长约1.3 kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明,MDPVS1株NS2基因全长1357 bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的MDPVFM株相比核苷酸序列同源性为99.26%,推导氨基酸序列同源性为98.23%。     

蓝狐多巴胺受体D2基因部分序列的克隆测序

对蓝狐多巴胺受体D2(dopamine receptor,DRD2)基因进行克隆测序,为进一步探讨蓝狐DRD2基因与自咬行为的相关分析及染色体定位提供理论基础。本试验参考狗的DRD2基因序列(GenBank登录号:AF293962.1)设计特异引物,对蓝狐的基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列的同源性分析。试验获得蓝狐DRD2基因序列819 bp,其序列与家犬的同源性最高,达97%,而在水貂和人及小鼠这些哺乳动物的同源性为85%~91%。本研究成功克隆了蓝狐DRD2基因的部分序列,表明其在物种间具有较高的保守性。     

杂交猪IL-2和IL-6全基因克隆及序列分析

为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序.测序结果表明:杂交猪IL-2基因核苷酸序列与参考序列的同源性为100%;IL-6基因核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的核苷酸同源性在99.8%～100%之间,推导氨基酸同源性在99.1%～100%之间.     

海兰鸡IL-18全基因的克隆与序列分析

IL-18是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp,与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物.运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy栽体上.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%.将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希茵细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒.