桃PpPGIP1 启动子的分离与功能分析

 通过染色体步移法分离桃[Prunus persica（L.）Batch]PpPGIP1 上游启动子序列,利用生物信息学方法对其功能进行初步预测;构建该启动子植物表达载体并通过农杆菌介导法转化烟草,研究不同激素诱导条件下GUS 蛋白瞬时表达情况;并利用实时荧光定量RT-PCR 技术分析了PpPGIP1 在水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）和1–氨基环丙烷–1–羧酸（ACC）诱导下的表达特性,获得了长度为1 018 bp 的桃PpPGIP1 启动子序列。该序列与梅和中国李PGIP 启动子序列的同源性分别为90%和89%;该启动子序列含有SA、MeJA、ABA 和ETH 诱导调控相关的抗病与胁迫顺式作用元件;ABA 和ACC 可以诱导PpPGIP1 启动子调控GUS 基因的表达;实时荧光定量RT-PCR 分析结果表明：SA、MeJA、ABA 和ACC 都可以诱导桃叶片中PpPGIP1 的表达。PpPGIP1 可能参与SA、MeJA、ABA 和ETH的信号转导,在桃抵抗病原菌和逆境胁迫方面起着非常重要的作用。     

柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析

【目的】以YFP为报告基因,构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。【方法】克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8,柠檬中同源基因Clcor8及其启动子p Clcor8;双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体p1D4,连接获得含启动子的中间载体;再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体,连接后获得重组质粒;通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。【结果】构建了p1D4/p Ptcor8-Ptcor8::YFP,p1D4/p Ptcor8-Clcor8::YFP和p1D4/p Clcor8-Ptcor8::YFP 3个融合表达载体,瞬时表达发现3个融合基因均可在冰糖橙叶片中表达。【结论】3个融合表达载体的成功构建为下一步转化柠檬,分析枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8的功能奠定了基础。     

香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建

研制经济方便的新型乙肝植物口服疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。研制乙肝植物口服疫苗遇到的一个主要的困难是HBsAg基因在受体植物中的表达量低。香蕉是植物口服疫苗理想的受体。因此,以香蕉为受体,进一步提高HBsAg基因表达量的研究非常必要。从pBIL2载体上克隆了香蕉果实特异表达的BanLec启动子,并引入了HindⅢ、BamHⅠ酶切位点;利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切YEPFLAG-HBS获得了HBsAg基因;通过BamHⅠ酶切位点,利用T4DNA连接酶连接了BanLec启动子和HBsAg基因,形成BanLec-HBsAg连接片段;再把该片段通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点插入pCAMBIA2300植物表达载体,成功构建香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因表达载体。     

番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98％,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。     

银杏GinNdly基因的植物表达载体构建

未知功能的植物基因一般需要通过转基因植物来研究和验证。银杏(Ginkgo biloba L．)是一种童期很长的古老植物，LEAFY基因是一个花分生组织特征基因，调控着植物开花的时间。用植物双元表达载体质粒pCAMBl-Al301构建了开花基因，LEAFY的银杏同源基因GinNdly的反义与正义植物表达载体。因pCAMBlAl301质粒的多克隆位点处没有启动子和终止子，将pB1121的35S启动子和nos终止子引入该质粒。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒构建正确，为研究银杏花分生组织特征基因GinNdly奠定了基础。     

蒙古沙冬青AmWRKY53基因表达分析及表达载体构建

以蒙古沙冬青为试材,分离到1个编码WRKY类转录因子基因,命名为AmWRKY53。该序列包含1个长为1 065bp的开放阅读框,编码354个氨基酸,具有1个WRKYGQK结构域和1个C_2HC锌指基序,属于Ⅲ型WRKY转录因子。荧光定量PCR方法检测了非生物胁迫下AmWRKY53在叶和根组织中的表达特点。结果表明:AmWRKY53受干旱和高盐诱导,参与逆境胁迫应答。构建的pPZP212-AmWRKY53植物表达载体,为进一步研究AmWRKY53的功能奠定了基础。     

番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98％,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。将LAT52启动子与GUS基因拼接,构建成了双元表达载体。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

双价抗病虫基因植物表达载体Lc-ChiA pBI121的构建

采用35S启动子将抗病基因玉米Lc转录因子和抗病虫基因棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)的几丁质酶(ChiA),连接到高效植物表达载体pBI121中,进行酶切鉴定。结果表明:含有上述2个基因,且转录方向相同的双价植物表达载体已经构建成功;含有上述2个基因的双价载体国内外尚未见报道,用于植物转基因研究,可提高植物抗病虫害能力。     

板栗贮存蛋白多样性的研究

对来自５个品种群的３３个板栗品种，应用薄层等电聚焦电泳技术进行贮存蛋白的多态性研究。结果表明：其贮存蛋白的多态性水平较高，可分离出２０种典型的带型；南北方品种的带型分化较明显；带型与品种原分布的地理区域存在着一定的相关关系。此外，还初步探讨了贮存蛋白的多态性及等电聚焦技术在品种鉴定上的应用。     

板栗基因组AFLP银染反应体系的建立

为了建立准确、高效、实用的板栗品种鉴别体系和方法,采用改进的CTAB—DNA提取方法,从板栗的嫩叶和老叶中提取获得总DNA。所得DNA样品的D260nm/D280nm值为1.7～1.9,琼脂糖凝胶上主带清晰、较少降解、样品纯度高、蛋白去除干净且获得率高。该体系使用操作简便、快捷、高效,适合于板栗DNA提取,所提取的DNA样品不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseI和EcoRI完全酶切,适合AFLP-PCR反应应用,得到清晰的指纹式样,适宜用作板栗品种鉴别的有效方法。     

板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及CmGID1基因的表达分析

 利用赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯利和吲哚乙酸分别涂抹板栗短雄花序,结果显示仅赤霉素能够抑制短雄花序顶端的细胞程序性死亡,并在一定程度上恢复短雄花序的伸长生长。通过RT-PCR扩增方法,从板栗短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中克隆出赤霉素受体基因GID1部分序列。测序及序列分析结果表明：克隆的cDNA片段为786 bp,所推导的氨基酸序列与杨毛果GID1氨基酸序列有91%的同源性,与陆地棉、蓖麻GID1均有85%的氨基酸序列同源性。经氨基酸序列功能分析,推测该GID1序列是板栗有编码功能的赤霉素受体基因,命名为CmGID1（GenBank登录号为HQ651231）。实时荧光定量PCR结果显示,从花序萌发至花药萌发前期,除其中一个时期（5月23日）外,芽变短雄花序CmGID1的表达量均高于正常雄花序;在花序的快速生长期,芽变短雄花序CmGID1表达量显著高于正常雄花序（P < 0.01）;且赤霉素处理后恢复生长的短雄花序CmGID1表达量显著降低（P < 0.01）。综合试验结果,初步揭示了该短雄花序为一个赤霉素缺陷型突变体。     

山东板栗遗传多样性分析

利用29对SSR引物对26份山东主栽板栗品种进行遗传多样性分析,以了解山东板栗的遗传多样性分布情况,为种质资源的利用和开发提供依据。结果表明,SSR的遗传多样性指数的分布范围为1．2720～2．9500,Simpson指数分布范围为0．5517～0．9409。可见,山东板栗具有丰富的遗传变异。根据系统聚类分析将26个板栗品种分为3大类。同时在3大类内又将品种进行细分,第Ⅰ类全部为胶东地区的材料,第Ⅱ类为鲁中南地区和泰沂山区的材料,分为3个亚类,第Ⅲ类只含有8019份材料,其结果说明山东的3个板栗主产区内部的品种或种质间亲缘关系较近,鲁中南地区和泰沂山区的品种或种质间可能有共同的起源。     

中国板栗3个野生居群部分表型性状的遗传多样性

本文对中国野生板栗秦岭山脉生态区、泰沂山脉生态区和燕山山脉生态区的3个种下居群的叶片、果实形态和坚果主要营养成分进行了调查研究,旨在为我国野生板栗资源的保护和可持续利用提供科学依据。结果表明,①3个居群的叶片大小、叶柄长度和粗度以及果实形状、大小和颜色等形态性状的变异系数均在10％以上,表现出丰富的遗传多样性,其中以叶面积及单粒重变异幅度和变异系数最大,而果形指数变异幅度和变异系数最小,是较稳定的植物学性状,3个居群的变异趋势基本一致。本文首次对秦岭山脉野生板栗表型性状进行了调查研究,其中单果重的变异幅度为1.69－3.89g,变异系数18.3%;坚果中边果的形状有近圆形、圆形、椭圆形、扁椭圆形、短椭圆形等;坚果表面颜色有淡红、棕褐、红褐、褐色等;果肉有浅黄色、乳黄色等;涩皮均易剥离,具有北方炒食板栗的典型特征。② 3个居群118个野生株系果肉中水分、总糖、淀粉、蛋白质、脂肪、灰分和维生素C等各种主要营养成分的含量在单株间差异显著,变异系数6.2％－28.3％,其中以坚果蛋白质含量的变异幅度和变异系数最大,遗传多样性丰富,3个居群的变异趋势基本一致;③同一性状在不同居群间大都存在显著或极显著差异,其中单叶面积和单粒重以秦岭山脉居群最小,分别为56.34cm2和2.95g,而维生素C含量最高（96.7mg/100g）,分别是燕山山脉和泰沂山脉居群的2.29倍和2.22倍。④相关分析结果显示,单粒重和单叶面积与降雨量和经度显著正相关,与海拔高度显著负相关,而维生素C含量与降雨量显著负相关,与海拔高度正相关,表明环境对板栗表型性状的遗传变异具有较大影响。因此,从野生板栗资源中进一步选择大果型、高蛋白质及高维生素C含量等优异种质类型的潜力很大。     

氧传感技术在板栗种子活力检测中的应用

【目的】探讨氧传感技术在板栗种子活力快速测定中的应用效果。【方法】分别采集板栗‘浙早1号’‘浙早2号’各5个母株的种子材料,通过老化处理0、24、48 h,分别获得各品种3个活力梯度的15份种子样品,然后进行氧传感测定以及室内标准发芽和田间出苗比较试验。【结果】经老化处理后,板栗种子活力开始下降,老化时间越长下降幅度越大。相关分析表明,氧气消耗指数(O_(CI))、氧气消耗速率(OCR)与‘浙早1号’板栗种子的标准发芽率、杭州及温州田间出苗率均呈显著相关,O_(CI)、理论萌发时间(TGT)与‘浙早2号’板栗种子的3个发芽指标均呈显著相关。【结论】O_(CI)是评价2个板栗品种种子活力的最佳指标,并在贮藏种子的活力检测中得到了验证。     

板栗和锥栗远缘杂交亲和性研究

以3个板栗品种"燕红"、"怀黄"、"怀九"为母本,以锥栗为父本,进行了远缘杂交亲和性及杂种表型特性研究,旨在为栗属植物的远缘杂交育种提供参考。结果表明:通过连续3a杂交试验,远缘杂交平均结实率仅23.6%,最低结实率只有6.5%,且空苞率较高,平均空苞率50.1%,最高77.5%;杂交结实特性在不同杂交组合、不同年份间存在差异,结实率在不同杂交组合间差异不显著,而在不同年份间表现差异显著,空苞率与坐苞率在不同杂交组合间差异显著或极显著,在不同年份间差异不显著;母本对结实率有较大影响,以"怀黄"、"怀九"为母本远缘杂交结实率较高且杂种优势明显,亲和性好,而"燕红"与锥栗杂交无论在结实率还是杂种特性上表现较差,说明合理选择亲本对于克服板栗与锥栗间远缘杂交不亲和性及提高结实率具有重要意义。     

茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

LEAFY基因植物表达载体的构建

本研究采用植物中间表达载体pBll21构建拟南芥花分生组织特性基因-LEAFY基因的植物表达载体。LEAYY基因带有植物组成型启动子-CαMV35S。该表达载体的构建为利用LEAFY基因进行木本果树遗传转化创造了条件。