黄瓜生长素响应因子CsARF10亚家族3个基因的克隆与表达分析

 利通过蛋白序列同源比对和PCR技术从黄瓜中克隆获得了3条生长素响应因子ARF10基因序列,分别命名为CsARF10a、CsARF10b和CsARF10c。系统发育进化树分析发现CsARF10a与番茄SlARF10基因进化距离较近,而CsARF10b和CsARF10c与拟南芥AtARF10相似性更高;启动子分析显示CsARF10家族基因具有多样化的激素应答元件,荧光定量PCR结果也证明黄瓜幼苗在不同NAA浓度处理以及其他激素的处理下,CsARF10家族基因呈现不同的表达模式;荧光定量PCR结果还显示CsARF10家族基因在黄瓜幼苗的根、茎、叶及雄花中都具有较高的转录水平;CsARF10a、b、c在黄瓜果实发育的早期具有相同的表达趋势,但CsARF10a的转录水平较高,而CsARF10b和CsARF10c表达量较低。     

杏鲍菇漆酶基因DNA片段的克隆及序列分析

参照Genbank中发表的杏鲍菇漆酶基因序列(No.AY686700),并根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计特异性引物。以杏鲍菇基因组DNA为模板,PCR扩增出长2 606 bp的漆酶基因片段,DNA经纯化后克隆到pGM-T载体上,经筛选、PCR鉴定和序列分析,证明该片段为完整的杏鲍菇漆酶基因(Genbank注册号KC789846)。通过对基因序列的内含子/外显子进行预测分析,获得漆酶编码区的cDNA,该基因的开放阅读框由1 596个核苷酸组成,编码一个由531个氨基酸组成的多肽,分子量大小约为56 682.0,等电点pI为4.56;比对结果发现该基因氨基酸序列与其他真菌漆酶的同源性最高达93%;进一步对X22-12漆酶二级结构进行分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。     

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物, 采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段, 分别克隆到pMD-18T载体并测序。结果表明, 本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基, 可编码218个氨基酸, 它们之间的核苷酸序列同源性较高, 达92.8% ～99.1%; 将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较, 显示出与CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%, 而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%。因此, 这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ。     

不同性别黄瓜EIN3基因片段克隆及序列分析

根据GenBank植物EIN3基因家族的保守序列设计了1对引物,以纯雌性系、强雌性系、雌雄同株系、两性花株系的不同性别黄瓜总DNA为模板,经PCR扩增得到6个725 bp左右的基因片段并进行序列比较分析。结果表明,不同性型黄瓜EIN3基因编码区有14个SNPs,平均51 bp发现1个SNP,检出率为1.96 %;其中有3个酶切位点突变,且发现编码区的SNPs有8个突变导致了氨基酸改变;初步建立了1个RFLP-BfmⅠ的酶切体系,发现在两性花株WI1983H中出现特异的酶切条带。     

桂花SVP同源基因的克隆及序列分析

试验以桂花‘日香桂'Osmanthus fragrans cv.rixianggui嫩叶为试验材料,根据转录组数据库中SVP基因的保守序列信息,通过PCR方法克隆得到日香桂SVP基因,将其命名为QfSVP,运用在线生物信息学分析工具对OfSVP序列进行分析。结果表明:OfSVP基因全长1325bp,开放阅读框(ORF)为687bp,编码228个氨基酸。氨基酸序列保守性分析发现,OfSVP所编码的蛋白中含有MADS-box基因家族特有的K-box区域。通过ProtParam ExPASy在线软件分析OfSVP蛋白质分子式为C1121H1859N327O364S9,分子量为26030.60Da,理论等电点PI值为5.80。不稳定指数为68.10,属于不稳定蛋白质。蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明OfSVP与油橄榄(Olea europaea)、黄连(Coptis chinensis)和芝麻(Sesamum indicum)的同源性分别达到94%、83%和82%;OfSVP基因的克隆与序列分析对于进一步了解桂花'日香桂'成花机理具有重要意义。     

黄瓜液泡膜H+-PPass基因CuPPase的cDNA克隆、序列分析与表达

 利用GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜H⁺-PPase 基因,命名为CuPPase,GenBank 注册号为GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高,分别为94%,92%。生物信息学分析表明,该基因全长2 650 bp,开放阅读框（ORF）2 307 bp,编码768 个氨基酸;CuPPase 蛋白大小约80 kD,理论pI值为5.32。该基因有14 个强的跨膜螺旋结构,PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明,CuPPase 在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导,但与处理时间有密切关系,其表达均表现先升高后降低的趋势。     

沙田柚RNase-like基因的克隆及序列分析

以沙田柚自交和异交花柱为试材,采用高通量测序技术对其进行转录组测序。通过差异分析得到RNase-like贮藏蛋白的基因序列,并研究了其理化性质。结果表明:该基因全长1 048bp(GenBank登录号为KR363153),开放阅读框(ORF)全长为693bp,共编码230个氨基酸,编码的蛋白质的分子量为25.82kDa,理论等电点为5.30,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2超家族成员。该蛋白为疏水性蛋白,可能的磷酸化位点共有15个。氨基酸序列同源性分析表明,该基因编码的氨基酸与甜橙和克莱门柚的同源性均为99%。系统进化树显示沙田柚RNase-like贮藏蛋白基因与甜橙,克莱门柚的亲缘关系较近,属于同一进化分支。     

低氮胁迫下黄瓜钙依赖蛋白激酶基因的克隆及表达分析

在低氮胁迫下,以黄瓜品种津研4 号叶片为供试材料,以cDNA 为模板,依据黄瓜基因组数
据库中Csa002986 基因编码区全序列,应用Primer Premier 5.0 软件设计引物,克隆得到黄瓜钙依赖蛋白
激酶基因（calcium-dependent protein kinase,CDPK）。该基因全长1 584 bp,编码527 个氨基酸。预测
该基因编码的蛋白是一个稳定的亲水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶结合区、EF 手型钙结
合区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点、N 酰基化位点等多个位点。CDPK 基因在不同氮浓度处理下黄瓜
各部位表达分析结果显示,在无氮条件下,CDPK 基因在茎尖表达量最高,其次为叶和茎;在低氮条件下,
CDPK 基因在茎中表达量最高,其次为茎尖和叶;在正常及高氮条件下,CDPK 基因在茎尖表达量最高,
其次为茎和叶。CDPK 基因在叶中的表达模式分析结果显示,在无氮及低氮胁迫下CDPK 基因表达量增加,
随着氮浓度的降低,CDPK 基因的表达量增加并明显高于对照;在高氮胁迫条件下,CDPK 基因的表达量
低于对照。     

龙眼LEAFY同源基因启动子的克隆与序列分析

为了解龙眼LEAFY同源基因（LLFY）的表达调控规律,应用染色体步移方法克隆了809 bp的LLFY启动子序列。用在线软件PlantCARE分析表明,该序列除含有启动子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,还含有参与生理周期调控、干旱诱导MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件等一些其他的调控序列,推测...     

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO 的克隆及其表达分析

 以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶--贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框（ORF）编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点（PI）8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。     

黄瓜矮化突变体膨胀素Cs-EXPA2基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR的方法克隆了黄瓜矮化突变体中膨胀素Cs-EXPA2基因,并对其苗期88 h内生长过程中mRNA水平表达量的差异进行了研究,探讨膨胀素基因对矮化的影响与作用.结果显示,Cs-EXPA2在黄瓜矮化突变体的下胚轴、根、子叶中均有不同程度的表达,利用Real-time PCR分析得出Cs-EXPA2的表达量随时空变化,Cs-EXPA2在下胚轴中的表达模式为"低-高-低",在根中的表达模式为"高-低-高".     

黄瓜CsaDMR6-2基因的克隆及特征分析

通过系统进化树和黄瓜霜霉病主效QTL分析,确定了与拟南芥抗霜霉病突变基因DMR6同源性较高的Csa DMR6-2基因为黄瓜霜霉病感病候选基因。以15份不同遗传背景的抗病和感病黄瓜自交系为材料克隆了Cs DMR6-2基因,经过与已知功能的拟南芥基因DMR6、DLO1和DLO2的氨基酸进行多序列比对、蛋白质二级和三级结构的预测,结果显示:欧洲温室型的抗病材料K15和K58的Csa DMR6-2的CDS序列在856bp处有1个碱基的突变,引起相应氨基酸由丝氨酸(TCA)变成丙氨酸(GCA),进而引起其部分蛋白质二级和三级结构的变化;Csa DMR6-2与拟南芥的DMR6、DLO1和DLO2基因具有很高的同源性,且同属于一类氧化酶,两者具有相同的结构域,而抗病材料的变异位点均发生在催化区。试验结果为进一步研究Csa DMR6-2的基因功能和利用感病基因获得霜霉病持久广谱抗性打下了良好的基础。     

黄瓜矮化突变体膨胀素Cs-EXPA2基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR的方法克隆了黄瓜矮化突变体中膨胀素Cs-EXPA2基因,并对其苗期88 h内生长过程中mRNA水平表达量的差异进行了研究,探讨膨胀素基因对矮化的影响与作用。结果显示,Cs-EXPA2在黄瓜矮化突变体的下胚轴、根、子叶中均有不同程度的表达,利用Real-time PCR分析得出Cs-EXPA2的表达量随时空变化,Cs-EXPA2在下胚轴中的表达模式为“低-高-低”,在根中的表达模式为“高-低-高”。     

黄瓜ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA的克隆及表达

 利用cDNA末端快速扩增技术, 从黄瓜叶片组织中获得脂肪酸去饱和酶基因（Cs-FAD）,其序列长度为1 807 bp,编码445个氨基酸,推导的氨基酸序列与已经报道的ω-3脂肪酸去饱和酶基因序列同源性较高,与桃果实的同源性最高（77%）。利用RT-PCR半定量分析显示,该基因在绿色组织如茎、叶、卷须里表达量较高,在根、花、果实及种子里也有少量表达。     

黄瓜NBS类型抗病基因同源序列的克隆与分析

 简要报道利用简并引物从黄瓜基因组DNA中分离得到15条NBS类型RGA, 登录GenBank获得登录编号分别为AY5554822AY555495和AY545993。其中10条为可通读序列, 与已报道的甜瓜RGA有较高的同源性。     

黄瓜扩张素蛋白基因CsEXPb1的克隆及表达分析

基于黄瓜果实转录组学研究,筛选并克隆了一个扩张素蛋白（β-expansin）基因CsEXPb1。蛋白序列同源比对发现CsEXPb1蛋白是一类钙调素类似蛋白（Calmodulin-like Protein,CML）,与甜瓜、草莓及番茄扩张素蛋白基因具有较高的相似性;ExPasy分析发现CsEXPb1为亲水性蛋白,亚细胞定位分析证明该蛋白广泛分布在细胞质以及细胞核结构中;qRT-PCR分析发现CsEXPb1无论是在授粉坐果还是单性结实坐果过程中皆上调表达,而在不授粉败育的果实中下调表达;qRT-PCR也表明CsEXPb1的表达受到生长素、细胞分裂素和赤霉素等单性结实诱导激素的正向调控,推测CsEXPb1与黄瓜坐果有关,可能参与了激素诱导的单性结实过程。     

黄瓜耐铜相关基因CsLecRK的克隆及表达分析

以黄瓜为试材,根据基因响应铜(Cu)的表达模式及保守性,采用基因克隆和生物信息学方法,对筛选获得的黄瓜凝集素受体激酶基因(CsLecRK)进行克隆及生物信息学分析,并对该基因在Cu胁迫条件的表达模式进行分析,以期探索黄瓜耐铜(Cu)的分子机制。结果表明:该基因cDNA全长为2 121 bp,编码706个氨基酸;理论分子量为78.36kDa,等电点为7.76。NCBI Blastp分析与进化树分析均表明,CsLecRK编码的蛋白与甜瓜的LecRK序列同源性最高(95%),进化距离最近。qRT-PCR分析表明,CsLecRK在Cu胁迫条件下表达明显下调。     

观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析

 以观赏桃品种‘红雨垂枝’为试材,采用SON-PCR方法从叶片中快速获得了查尔酮合成酶基因全长序列,命名为PphCHS,GenBank登录号为JN391444,其长度为2353 bp,具有一个1140 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码379个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,PphCHS与已报道的其他植物的CHS推导的氨基酸序列具有高达90%以上的相似性;氨基酸聚类分析表明：观赏桃首先与樱桃李聚类,其次与草莓。生物信息学分析表明：PphCHS蛋白含有查尔酮合酶家族的特征多肽序列RLMMYQQG CFAGGTVLR,不含信号肽序列。     

黄瓜转录因子CsCBF3 的克隆及表达分析

利用RT-PCR 技术从黄瓜中克隆了植物低温信号转导途径中的关键转录因子C-repeat-Binding
Factor3,将其命名为CsCBF3,GenBank 登录号为JQ900769。CsCBF3 基因开放阅读框全长为615 bp,
编码204 个氨基酸。进化树分析表明,CsCBF3 隶属于CBF 基因家族,与葡萄CBF3 蛋白亲缘关系最近,
而与黑麦草、水稻CBF3 蛋白亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,CsCBF3 编码的蛋白包含保守的
AP2 DNA 结合域,N 端的核定位信号区和C 端的酸性氨基酸富集区,且该蛋白中的一些磷酸化位点及二
级结构在与DNA 互作过程中发挥重要作用。荧光定量PCR 检测结果显示低温可诱导CsCBF3 的表达,且
其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明CsCBF3 是一个快速响应基因,推测其在黄瓜耐冷过程中起着重
要的作用。