利用PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因

 利用同一PCR反应体系，对分别与番茄抗根结线虫的 基因和抗斑萎病毒(1w V)的Sw一5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合，其中与基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记，抗感试材均产生750 bp的特异片段，纯合和杂合抗病基因型试材存在 I酶切位点，酶切后分别产生了570 bp、160 bp和750 bp、570 bp、160 bp的不同特异性片段，而感病基因型试材无 I酶切位点；与Sw一5基因紧密连锁的SCAR2标记为显性标记，只有抗病试材扩增出400 bD的特异性片段。经反复验证，结果稳定准确可靠，可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。     

利用多重PCR反应同时鉴定番茄Ty-3a基因和抗溃疡病QTL

番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病是两种分布广泛、危害严重的世界性病害,严重影响了番茄的产量,是国内外番茄抗病育种的重要目标。为了提高抗病育种的效率,研究建立了抗番茄黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和抗番茄溃疡病QTL的多重PCR反应体系。该体系利用同一PCR反应,对分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-3a基因和抗番茄溃疡病的一个QTL位点Rcm5.1紧密连锁的标记进行了扩增、筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Ty-3a基因紧密连锁的标记Ty-3F/Ty-3R为共显性标记,基因型为Ty-3a/Ty-3a的材料均产生630 bp的特异性片段,基因型为ty-3/ty-3的材料均产生320 bp的特异性条带,基因型为Ty-3a/ty-3的材料产生630 bp和320 bp的特异性片段;与番茄溃疡病QTL位点Rcm5.1连锁的标记TG318F/TG318R为显性标记,只有抗病材料产生580 bp的特异性片段,感病材料不产生特异性条带。经反复验证结果准确、稳定,可用于同一PCR反应体系中对番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和番茄溃疡病QTL的同时筛选鉴定。     

番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 TY-1的 PCR 检测

利用特异引物对3份抗病纯合材料(基因型Ty-1/Ty-1)和4份感病纯合材料(基因型ty-1/ty-1)进行PCR扩增,抗、感材料均产生398bp的PCR扩增片段,抗病和杂合抗病材料的酶切产物存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303和98bp以及398、303和98bp的片段,而纯合感病材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为398bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及抗病杂合材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对13份番茄杂交种进行检测,有8份杂交种含有Ty-1抗病基因,3份材料不含Ty-1抗病基因。利用这条标记对国内的13份番茄自交系进行检测,13份材料均不含Ty-1抗病基因。     

番茄抗病基因Ty-1的CAPS标记及检测

为了获得番茄抗病基因Ty-1的分子标记,利用特异引物对3份抗病纯合材料（基因型Ty-1/Ty-1）和3份感病纯合材料（基因型ty-1/ty-1）进行PCR扩增,抗病、感病材料均产生400 bp的PCR扩增片段,感病和杂合抗病材料的酶切产物存在RsaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了350、50 bp以及400、350、50 bp的片段,而抗病纯合材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为400 bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对33份番茄F1进行检测,有20份材料含有抗病基因Ty-1,13份材料不含抗病基因Ty-1。利用该标记对国内的24份番茄自交系进行检测,24份材料均不含抗病基因Ty-1。经反复验证,结果准确可靠,该标记可以用于对番茄抗病基因Ty-1的筛选鉴定。     

番茄Ty-1、Ty-2和Ty-3基因的多重PCR技术鉴定

试验探索在同一个反应体系中完成3个SCAR标记的多重PCR扩增,为利用分子标记辅助番茄黄化曲叶病抗性育种提供一种省时、省力、经济有效的方法。对分别与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3紧密连锁的共显性SCAR标记同时进行扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段一致。     

番茄抗黄化曲叶病ty-5基因的PCR快速检测

以番茄抗病材料CLN32120a-23(含ty-5基因)和感病材料Moneymaker(不含抗病基因)为试材,通过杂交、自交获得的F1、F2代,利用SSR分子标记技术筛选出了1个与抗病性状共分离的共显性SSR标记。结果表明:该标记在CLN32120a-23中可以扩增出550bp的条带,在Moneymaker中可以扩增出780bp的条带,在F1中可以扩增出上述2条条带,标记结果与田间鉴定基本一致,证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄抗黄化曲叶病毒病基因ty-5紧密连锁的共显性标记。对27份番茄材料进行检测,鉴定出有15份材料基因型为ty-5/ty-5,分子标记检测与田间检测结果吻合率达80%。该标记可用于番茄抗黄化曲叶病毒ty-5基因的PCR快速检测,同时为ty-5分子标记辅助选择育种的应用提供一定的参考依据。     

与番茄灰叶斑病抗病基因Sm连锁的CAPS标记开发

利用与番茄灰叶斑病Sm基因连锁的RFLP标记,设计开发了一个CAPS标记,用于抗番茄灰叶斑病育种。以已知抗病基因型的番茄种质为材料,参照与Sm基因紧密连锁的RFLP标记设计特异引物,进行PCR扩增,产物克隆测序分析寻找特异性酶切位点,开发了一个与抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记,命名为T280。利用特异引物T280进行PCR扩增,供试材料均扩增出1条655 bp的特异条带。经限制性内切酶Mme I酶切后,抗病纯合材料仍保留1条655 bp的特异条带,感病纯合材料产生206 bp和449 bp的特异条带,抗病杂合材料产生206 bp、449 bp和655 bp的特异条带。利用不同遗传背景的番茄材料对该标记进行验证,结果发现,能够区分抗病杂合、抗病纯合和感病纯合材料。开发的CAPS标记稳定可靠,是一个比较理想的共显性CAPS标记,可用于Sm基因的分子标记辅助育种。     

四重PCR技术鉴定番茄Ty-1、Ty-2、Mi和Cf-5基因研究

以番茄为试材,只利用1次PCR反应体系,同时对与番茄黄化曲叶病毒病(Tomatoyellow leaf curl virus)的Ty-1、Ty-2基因、番茄根结线虫病(Root-knot nematode)的Mi基因和番茄叶霉病(Leaf mold)的Cf-5基因紧密连锁的SCAR标记进行了筛选.结果表明:扩增的特异性片段和单引物扩增的片段吻合,即对与Ty-1基因、Ty-2基因、Mi基因和Cf-5基因紧密连锁的片段特异性扩增,所获得的片段大小分别是395、900、750和960 bp.经TaqI酶切后所获得的特异性片段大小与前人试验所得大小基本相同,初步证明了四重PCR检测的准确性.该体系可对Ty-1、Ty-2、Mi和Cf-5 4个抗病基因进行同时筛选,在苗期辅助选择.降低了生产成本,节约时间、人力、物力,为分子标记辅助选择育种奠定了基础.     

用于黄瓜白粉病抗病性鉴定的SCAR标记

将黄瓜白粉病抗性相关基因的一个共显性AFLP标记成功地转换为简单、实用的SCAR标记。根据AFLP标记片段序列信息 设计了两对特异性引物SCPM166和SCPM66。PCR扩增结果显示,SCPM166在抗病亲本、抗病单株和杂合类型单株中均扩增出了大 小为166 bp的特异片段,感病亲本与感病单株均无此特异片段,表明该SCAR标记可以鉴定纯合感病个体;SCPM66在感病亲本 、感病单株和杂合类型单株中均扩增出了大小为66 bp的特异片段,抗病亲本与抗病单株均无此特异片段,表明该SCAR标记可 以鉴定纯合抗病个体。若将两个显性SCAR标记结合起来,相当于一个共显性的SCAR标记。     

番茄黄化曲叶病毒抗病基因Ty-2的SCAR标记筛选

以抗病杂合体(Ty-2/ty-2)、抗病纯合体(Ty-2/Ty-2)和感病纯合体(ty-2/ty-2)番茄为试材,以提取植物的基因组DNA作为模板,根据与抗病基因Ty-2紧密连锁的RFLP标记设计特异引物,采用DNA聚合酶链式反应的方法,筛选获得了2个与抗病基因Ty-2紧密连锁的、且稳定可靠的SCAR标记,分别命名为T0302-1和T0302-2。结果表明:T0302-1和T0302-2两个标记均为共显性分子标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。该研究旨在筛选获得与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-2紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。