第一个不受美国农业部监督的CRISPR-Cas9基因组编辑作物

正基因组编辑工具在2014年9月29日被国际学术期刊《自然—方法》评为在过去10年中对生物学研究影响最深远的十大技术之一。作为一种精确有效的基因敲除方法,CRISPR-Cas9技术是当前最热门的基因组编辑工具。据国际学术期刊《自然》2016年4月14日报道,美国宾夕法尼亚州立大学的植物病理学家培育的抵制褐变的白色双孢菇(Agaricus bisporus)成为第一个不受美国农业部(USDA)监管的CRISPR-Cas9技术产生的基因组编辑作物。双孢菇是世界食用菌生产规模     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

应用CRISPR/Cas9体系对番茄PSY 1基因的定点编辑

基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除青花菜BoSP11创制自交亲和系

通过CRISPR/Cas9技术敲除SRK基因或者SP11基因可以直接将甘蓝类蔬菜自交不亲和材料改造成自交亲和材料。本研究中根据全基因组重测序获得青花菜(Brassica oleracea var.italic) BoSP11基因序列,构建双靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法对BoSP11进行敲除。结果显示,获得的29株转基因植株中有23株发生基因突变,编辑效率为79.3%。TA克隆测序结果表明有4株为纯合突变,19株为杂合突变。统计纯合突变T₀代自交结籽情况发现花期自交亲和指数高达6.82,为目前所报道的能获得的亲和性最高指数。T₁代植株在隔离大棚中通过蜜蜂授粉平均单株采收种子24.8 g,完全实现不需要人工干预完成亲本材料的自交繁育。     

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。     

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

应用反义基因技术抑制水果成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决水果延熟保鲜难题的可行新方法。一个来自甜瓜的ACC氧化酶cDNA全序列被反向插入到植物表达载体pBI121中,从而构建了甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体。用该反义基因载体转化烟草获得转基因植株,并且转基因在转化植株的自交子代中发生孟德尔分离,由此验证了该载体构建的成功和可用性。此项研究为下一阶段用该反义基因载体转化甜瓜栽培品种做了充分必要准备。     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proD AM3:GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4%,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4%,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合。测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换。GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。