番茄Ⅱ型metacaspase蛋白SlMC7抗体效价检测及其在果实中表达特性分析

以原核表达的番茄SlMC7重组蛋白为抗原,制备SlMC7多克隆抗体,采用ELISA和蛋白质点杂的方法,研究了番茄II型metacaspase蛋白(SlMC7)的抗体效价和表达特性,并对SlMC7蛋白及基因在番茄果实发育过程中的表达差异进行了研究,以期为后续的SlMC7在番茄果实中功能性研究提供材料基础和参考依据。结果表明:SlMC7多克隆抗体效价在256 000以上,在1∶10 000的稀释度下,可识别低至1.6ng的纯蛋白。对各时期番茄果实Western-blot和Real time PCR结果表明,相对于绿熟期,SlMC7蛋白及基因在破色期果实中表达量显著上升,表明SlMC7与番茄果实成熟存在一定相关性。     

羽衣甘蓝ARC1的抗体制备及蛋白表达分析

ARC1是芸薹属植物自交不亲和(Self-incompatibility,SI)信号复合体下游传递因子,特异性地介导SI信号传递。利用原核表达系统对羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)ARC1的全长蛋白(1~663 aa,BoARC1-F)、UND结构域蛋白(1~279 aa,BoARC1-N)和ARM结构域蛋白(361~663aa,BoARC1-C)进行重组表达。SDS-PAGE结果显示这3种蛋白分别在分子量68、33和38 kD处特异性地诱导表达。利用Ni~(2+)-NTA树脂亲和层析技术获得重组蛋白。将BoARC1-C蛋白免疫小鼠并通过细胞融合技术制备单克隆抗体,获得2株单克隆抗体。交叉反应试验结果显示制备的单克隆抗体具有ARC1识别特异性。通过免疫印迹技术检测BoARC1在不同组织和不同发育阶段柱头中的表达,结果显示BoARC1特异性地在羽衣甘蓝柱头中表达,而且在开花阶段的柱头表达量最高。     

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

 通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFP_{1( 2)} 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达, 其融合表达产物约22 kD, 约占总可溶蛋白的0. 45% ( 0. 5%) 。抑菌活性试验表明: 重组Rs-AFP_{1( 2)}有抑菌活性, 其中Rs􀀁AFP2 较Rs􀀁AFP1 抑菌活性强。构建了Rs-AFP₂ 基因的植物表达载体pBIAFP₂。利用农杆菌介导法将pBIAFP₂ 导入番茄中, 并诱导出完整的植株32 株。对其中28 株进行PCR 和PCR-Southern Blot 检测, 其中17 株呈阳性。对经PCR Southern Blot 检测呈阳性的植株进行Southern Blot 检测, 6 株呈阳性。     

山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用双生病毒简并引物PA/PB,对山东寿光地区保护地疑似感染番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的番茄植株进行PCR检测,结果证明番茄病叶由TYLCV侵染所致。以提取的病叶总DNA为模板,扩增得到长约770 bp的TYLCV-CP基因片段,克隆至pEASY-T1 Simple载体,然后用Xho I和EcoR I将其切下并插入到pET-32a表达载体中,构建了寿光地区TYLCV分离物的外壳蛋白基因原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导获得了50 kD重组蛋白,Ni2+-NTA亲和层析纯化和Western印迹分析证明目的蛋白为TYLCV外壳蛋白,且具有良好的抗原活性。     

温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白基因克隆与原核表达及其抗体制备

 用RT-PCR方法,从采自重庆奉节的‘宫本’柑橘的2个样品中扩增出温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus,SDV）SDV RNA2的3′末端,长度为975 bp,与报道的SDV S-58 3′末端序列同源性分别为98.7%和98.4%。根据获得的序列设计引物,以含有SDV FJ 3′末端序列的质粒为模板,PCR扩增获得大小为 654 bp的SDV-FJ小外壳蛋白（Small coat protein,CPS）基因产物。构建了CPS与GST融合表达载体PGEX-CPS,在37 ℃、1.0 mmol · L-1 IPTG条件下诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明成功表达出分子量约为42 kD的GST-CP融合蛋白。以表达的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/12 800。用获得的抗体进行组织印迹分析表明,SDV在柑橘叶柄基部韧皮部维管束区域含量最高。     

番茄CCCH型锌指蛋白基因SlC3H64和SlC3H65的特征与表达分析

以番茄品种"中蔬6号"为试材,采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术,分析研究了番茄SlC3H64和SlC3H65锌指蛋白结构特点,启动子序列内所含胁迫响应元件类别,以及2个基因组织表达模式和非生物胁迫条件下表达量变化差异。结果表明:番茄SlC3H64和SlC3H65的蛋白预测结构差异较大;启动子序列分析发现,2个基因中分别含有11个和7个不同的胁迫响应元件,且二者除了TC-rich repeat元件相同外,其余元件均不同;SlC3H64和SlC3H65在"中蔬6号"根、茎和叶中都有表达,且都在叶中表达量最高,5种不同胁迫处理条件下,SlC3H64响应水杨酸(SA)和高温处理,而SlC3H65则仅响应甘露醇处理。     

番茄LeEIL1基因表达工程菌的构建及表达分析

 以番茄果实为材料,通过RT-PCR扩增出番茄leEIL1基因,并构建了3种表达载体。表达结果比较分析表明,在以pPIC9k为表达载体,KM71毕赤酵母为宿主细胞的真核表达体系中,LeEIL1蛋白质的表达结果明显优于在以pET30a和pET15b为载体,BL21（DE3）plyss大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系中的表达结果。     

番茄果实特异性表达有机磷水解酶的农药降解活性分析

为研究番茄果实中表达有机磷水解酶（OPH）降解有机磷农药的活性,经农杆菌介导,将携带表达元件E8-OPD的植物表达载体pSE80P遗传转化番茄子叶,通过抗性筛选和分子检测,获得6株GUS染色和PCR扩增阳性的转基因番茄植株。     

AtGDPD-Like 6和AtGDPD-Like 7基因启动子表达特性及AtGDPD-Like 6蛋白定位

以野生型(Col-0)拟南芥为试材,采用RT-PCR法,研究AtGDPDL6和AtGDPDL7基因组织表达特性。以ProAtGDPDL6::GUS和ProAtGDPDL7::GUS转基因拟南芥为试材,采用GUS组织化学染色法,研究AtGDPDL6和AtGDPDL7基因启动子表达模式,并以Pro35S::AtGDPDL6-GFP转基因拟南芥为试材,采用激光共聚焦显微镜进行荧光观察,研究AtGDPDL6蛋白的细胞内定位。结果表明:AtGDPDL6基因在拟南芥花组织中特异表达;AtGDPDL7基因在花和角果中特异表达。AtGDPDL6和AtGDPDL7基因特异表达在拟南芥成熟的花粉囊和柱头中。AtGDPDL6蛋白定位于细胞膜和细胞壁区域。     

拟南芥抗病基因FLS2和LysM的亚克隆及其在番茄中的表达

从拟南芥JAtYTAC基因组文库中完整地亚克隆了FLS2和LysM两个抗病基因,亚克隆的DNA片段中分别包含各自的启动子、内含子和终止子.利用农杆菌介导的方法分别将这两个基因转化番茄品种'Moneymaker',转基因植株经PCR初步筛选后再分别提取总RNA进行RT-PCR,以验证其是否在'Moneymaker'中表达.试验结果表明,FLS2和LysM均能成功地在'Moneymaker'中表达,说明番茄的转录系统不仅能识别这两个抗病基因的启动子并起始转录,还能正确识别并剪切这两个基因的外显子和内含子.据此推测,拟南芥和番茄这两个远缘物种的转录机制存在相对保守的成份,这为探索在这两个物种间R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考.     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

苹果糖转运蛋白基因MdSWEET1在番茄中异源表达提高其耐盐性

克隆得到苹果糖转运蛋白SWEET(sugars will eventually be exported transporters)基因MdSWEET1(MDP0000237435),组织表达分析发现该基因主要在苹果的茎和花中表达,相对定量分析发现其对NaCl、PEG、H_2O_2和ABA等均有响应。在番茄中异位表达MdSWEET1可提高植株耐盐性,并且可溶性糖含量,特别是蔗糖和果糖含量提高。     

香蕉果实转录因子MaWRKY1基因的原核表达和多克隆抗体制备

MaWRKY1是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能,制备了MaWRKY1多克隆抗体。选取MaWRKY1基因全长中N端第168 ~ 400个氨基酸之间的包括两个WRKYGQK保守域的cDNA序列,构建了原核表达载体pET-MaWRKY1,并转化到大肠杆菌BL21中诱导表达菌体蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果表明,His-MaWRKY1融合蛋白成功获得了高效表达,分子量在26 kD左右。His-MaWRKY1融合蛋白经过Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到0.5 mg • mL-1。经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清,采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（ELISA）和蛋白质印迹（Western blot）分析,表明所制备的抗体具有很好的效价,效价比为1︰160 000,同时具有良好的灵敏度和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白,Western blot检测显示,在分子量26 kD左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗体可以与香蕉WRKY蛋白特异性结合,并且低温可以诱导香蕉果实中MaWRKY1蛋白表达,暗示MaWRKY1蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。     

柿果实扩张蛋白基因cDNA克隆及原核表达

以‘富平尖柿’（Diospyros kaki L.‘Fuping Jianshi’）果实不同发育时期提取的总RNA为模板,利用RT-PCR结合RACE技术扩增得到5个扩张蛋白基因：成熟期CDK-Exp3（1 168 bp）,转色期CDK-Exp4（1 120 bp）和CDK-Exp5（1 018 bp）,膨大期CDK-Exp6（1 129 bp）和CDK-Exp7（1 121 bp）;5个基因的开放阅读框（ORF）均为765 bp,编码254个氨基酸;构建了CDK-Exp3原核表达载体pET-CDK-Exp3,并转化于E.coli BL21（DE3）,SDS-PAGE检测结果显示表达了一个约43 kD的蛋白。     

番茄中ABC转运蛋白SlABCG23调控茉莉酸信号途径

茉莉酸（jasmonic acid,JA）的运输依赖于转运蛋白的参与。ABC(ATP binding cassette)转运蛋白参与植物体内多种物质的运输。已知在番茄中存在4个与拟南芥中JA转运蛋白具有较高同源性的ABC转运蛋白。对其进行了Motif、蛋白质结构域和跨膜结构分析,并选取其中的SlABCG23进行功能初步鉴定,推测其可能与JA信号途径的调控有关。构建了SlABCG23的过表达载体,通过农杆菌侵染法得到3株过表达番茄植株。通过表型分析发现,SlABCG23过表达植株的花器官增大,花粉萌发受阻,果实内种子发育异常且体内JA含量降低。推测SlABCG23可能通过影响JA的含量参与调控JA信号途径。     

拟南芥抗病基因FLS2和LysM的亚克隆及其在番茄中的表达

 从拟南芥JAtYTAC基因组文库中完整地亚克隆了FLS2和LysM 两个抗病基因, 亚克隆的DNA 片段中分别包含各自的启动子、内含子和终止子。利用农杆菌介导的方法分别将这两个基因转化番茄品种‘Moneymaker’, 转基因植株经PCR 初步筛选后再分别提取总RNA 进行RT-PCR, 以验证其是否在‘Moneymaker’中表达。试验结果表明, FLS2和LysM 均能成功地在‘Moneymaker’中表达, 说明番茄的转录系统不仅能识别这两个抗病基因的启动子并起始转录, 还能正确识别并剪切这两个基因的外显子和内含子。据此推测, 拟南芥和番茄这两个远缘物种的转录机制存在相对保守的成份, 这为探索在这两个物种间R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考。     

牡丹病程相关蛋白1基因的克隆及表达分析

 以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌Cylindrocladium canadense处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料,根据已发表植物PR1的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得病程相关蛋白1基因的cDNA,命名为PsPR1。该序列全长为744 bp,5′和3′非翻译区分别有42 bp和225 bp。该基因有477 bp的开放阅读框（ORF）,编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量14.8 kD,等电点（pI）6.19,具有典型的SCP_PR1_like保守结构域。通过Blast比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高,在正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质SA的显著诱导,分别在处理的24 h和12 h达到最高峰,说明PsPR1可能参与了牡丹的抗病防御过程。     

番茄SlIAMT1和SlIAMT2的表达及其对下胚轴和根生长的调控

从'Ailsa Craig'番茄中克隆到两个IAA甲基转移酶(indole-3-acetic acid methyltransferase,IAMT)基因SlIAMT1和SlIAMT2,其全长分别为2510和4620 bp,均编码390个氨基酸.序列分析表明,二者均具有IAA甲基转移酶特异的底物结合位点和催化位点,与拟...     

砂梨山梨醇转运蛋白(SOT)基因家族成员表达特性及在果实糖积累中的作用初探

山梨醇转运蛋白(SOT)是植物山梨醇运输的关键载体。参考已公布的白梨基因组数据,应用RNA-seq技术在砂梨果肉中鉴别出22个有表达的山梨醇转运蛋白(SOT)基因家族成员,其中10个高表达成员的表达量之和占总表达量的92%。q RT-PCR分析表明上述10个成员的表达存在明显的组织特异性,所有成员在种子中的表达丰度最低;Ppy SOT8在所有组织和器官中都有不同程度表达;Ppy SOT26仅在幼叶中有一定表达。在果实发育期间Ppy SOT2、Ppy SOT8、Ppy SOT10/28和Ppy SOT33的相对表达丰度与果实山梨醇积累呈现良好相关性。4℃贮藏期间果实山梨醇含量趋于下降,与Ppy SOT3、Ppy SOT4、Ppy SOT8、Ppy SOT25、Ppy SOT32和Ppy SOT33表达上调相关。     

苹果MdDRB1基因在番茄中异位表达与功能研究

【目的】将苹果Md DRB1基因转入番茄中,探究苹果MdDRB1基因在番茄中的异位表达与功能。【方法】采用农杆菌介导法,将苹果基因Md DRB1转入番茄植物体内,用PCR检测到该基因已整合到番茄总DNA中。对获得的5个转基因番茄株系进行半定量RT-PCR分析,挑选MdDRB1基因表达水平由低到高的3个株系,用实时荧光定量PCR检测与生长素有关的mi RNAs及相应靶基因的相对表达量。并对非转基因和转基因番茄进行3μmol·L-1IAA和5μmol·L-1IAA处理,对植株进行向光性检测。【结果】转基因株系中miR164、miR160、mi R393表达量下调,mi R167表达量上调,同时,它们分别对应的番茄中的靶基因SlNAC1、SlARF10和SlARF16、SlTIR1的相对表达量上调,SlARF8相对表达量下调。IAA处理后,转基因株系幼苗的侧根数目比未转基因植株增多,同时,转基因株系幼苗的向光性也增强。【结论】苹果Md DRB1基因在番茄中的异位表达,通过抑制生长素响应相关的mi R164、miR160、miR393和增加miR167的积累水平,部分解除其对下游靶基因SlNAC1、SlARF10和Sl ARF16、SlTIR1以及增加Sl ARF8的转录后基因沉默作用,进而提高了转基因番茄对生长素响应的敏感性。