猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

猪瘟病毒一步法RTPCR检测方法的建立

 本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA,经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法,RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份,阳性检出率为92.3%;结果表明,建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5＇端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针，建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株，未能检测出牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞；对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析，与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50／mL，整个试验流程只需2h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本，两种方法的检出率分别为17．4％和13．5％，两者符合率为95．7％（198／207）；荧光RT-PCR的检出率高于ELISA，两者差异显著。结果表明，建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪组织和猪瘟疫苗中猪瘟病毒的检测和比较

采用RT-PCR方法和荧光RT-PCR方法检测了疑似猪瘟病料、采自屠宰场的猪淋巴结和猪扁桃体、细胞源猪瘟疫苗、脾淋源猪瘟疫苗等样品中的猪瘟病毒。结果表明,两种方法的检测结果一致,并且都只从1份疑似猪瘟病料和细胞源猪瘟疫苗中检出猪瘟病毒,其余样品中未检出猪瘟病毒。     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

豫北地区猪瘟流行病学调查及分析

为了掌握豫北地区猪瘟的免疫和野毒感染状况,更好地为开展相应的免疫预防工作提供依据,试验分别应用猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒以及RT-PCR方法分别对豫北6地市送检的血清及病料进行了猪瘟抗体、猪瘟抗原的检测,结果显示,所检测的血清总阳性率为74.96%,提示该地区猪瘟疫苗免疫效果较差;猪瘟抗原阳性率为30.09%,说明目前豫北地区的猪场普遍存在猪瘟野毒感染,RT-PCR的结果有力地佐证了这一点。     

用金标卡与RT-PCR对猪瘟的快速诊断及其病毒E2基因的序列分析

试验用金标卡对临床检查疑似猪瘟的病猪抗体和抗原分别进行初步检测,同时根据GenBank已发表的猪瘟病毒E2基因的cDNA序列设计并合成1对特异性引物,提取病料总RNA,通过RT-PCR技术扩增长1 137 kb的E2基因片段并进行验证,再将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建了重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切和序列测定,说明均已成功获得了猪瘟病毒E2基因和重组体pMD18-T-E2.测序结果与国内外已发表的毒株分别进行序列同源性比较和数据分析及绘制系统进化树,结果表明:该毒株与国内标准毒株Shimen株和C株具有较高的同源性.表明用金标卡结合RT-PCR能对猪瘟进行快速诊断.     

南疆某规模化猪场猪瘟病原与抗体的检测分析

研究旨在调查南疆某规模化猪场免疫猪群的猪瘟抗原与抗体水平,为制定适应当地生产条件的免疫程序提供参考。试验运用酶联免疫吸附试验(ELISA)对该场免疫猪群的480份血清样品进行抗体检测与分析,并采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对采集的24份猪瘟疑似病料进行抗原检测。结果显示,对随机采集的480份血清样品进行猪瘟抗体检测,其中449份为阳性样品,阳性率为93.5%;不同类别群体中以母猪的抗体阳性率最高,为97.2%;2～4胎母猪与5～6胎母猪的抗体阳性率为97.8%;22～28 d的阳性率最低,为76.9%;36～50 d的仔猪抗体阳性率最高,为92.3%。对采集的24份猪瘟疑似病料进行抗原检测,显示均为阴性。研究表明,该规模化猪场的猪瘟免疫情况良好,未出现感染情况。     

某规模化猪场猪瘟和猪圆环病毒病2型混合感染的诊断

为调查贵州省某规模化猪场送检病料的感染状况,试验首先对该猪场进行了流行病学调查和临床症状观察,并对送检的2头发病仔猪进行病理剖检,然后采用ELISA方法对该猪场送检的80份血液样品进行了CSFV和PCV2血清学检测,最后采用RT-PCR和PCR技术进行确诊。结果表明：通过流行病学调查、临床症状观察、病理学剖检和ELISA方法检测猪瘟和猪圆环病毒病2型的血清抗体阳性率分别为56.25%和52.5%后,初步判定该猪场疑似猪瘟和猪圆环病毒2型混合感染;RT-PCR和PCR检测确诊该猪场为猪瘟和猪圆环病毒病2型混合感染。     

2015—2016年广西梧州市主要病毒性猪病的检测与分析

采用RT-PCR及PCR技术,对广西梧州市7个县（市、区）屠宰场2015—2016年送检的1 304份猪组织样品（肺脏、淋巴结、脾脏）进行高致病性蓝耳病病毒（HPRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）核酸检测,对7个规模场送检的70份病死猪组织病料样品（肺脏、淋巴结、脾脏）进行HPRRSV、CSFV、伪狂犬病病毒（PRV）、圆环病毒（PCV）核酸检测。采用ELISA技术,对梧州市7个县（市、区）送检的8 572份血清检测猪瘟免疫抗体,对2 066份血清检测猪蓝耳病免疫抗体。结果显示：HPRRSV、CSFV核酸检测均为阴性;规模场病死猪组织病料的PRV核酸阳性率为14.3%,PCV为57.1%;猪瘟免疫抗体合格率为90.41%,蓝耳病免疫抗体合格率为73.48%。监测结果表明：梧州市流行的生猪高热病主要涉及猪伪狂犬病和猪圆环病毒病2种病毒病;猪蓝耳病和猪瘟的强制免疫,有效控制了该地主要猪病毒性疫病的发生与流行。     

国外猪瘟病毒实验室诊断、流行病学以及标记疫苗研究进展

常用于检测猪瘟病毒的实验室诊断方法是免疫组化和病毒分离培养.随着分子生物学的发展,先后建立了一系列检测病毒蛋白的ELISA方法以及病毒基因组的RT-PCR方法.标记疫苗是目前猪瘟疫苗发展的趋势.目前已经完成E2亚单位标记疫苗及重组活疫苗效率的测定,均能显著减少疫苗免疫猪群中猪瘟病毒的水平及垂直传播,同时通过血清学方法能区分疫苗免疫猪与自然感染猪.标记疫苗的使用对于猪瘟的控制和消灭具有十分重要的意义.     

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。     

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

根据欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计E1和E6 2套PCR引物和TaqMan荧光探针,建立E1和E6荧光RT-PCR方法,用于检测PRRSV。反应条件优化后,用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行PCR扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示,建立的E1和E6荧光RT-PCR可以检出欧洲型PRRSV,敏感性依次为616和216个拷贝的PRRSV重组质粒DNA,而CSFV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可作为检测欧洲型PRRSV的技术储备。     

猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立

根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT-PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性.RT-PCR最少可检测到1 000EID50的病毒量核酸,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

猪瘟病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）巢式RT-PCR（nested RT-PCR）方法,本研究参照GenBank中公布的CSFV E2基因保守区域序列设计2对特异性引物,以CSFV总RNA为模板,优化反应条件,建立CSFV nested RT-PCR方法,对其进行特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了应用检测,并对阳性PCR产物进行克隆测序鉴定。结果表明,本研究成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法,能够特异性地扩增CSFV,但对ST正常细胞对照和其他8种病原对照未扩增出任何条带;稳定性和重复性好;敏感性高,最低检测病毒含量为1 TCID₅₀;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,PCR阳性产物克隆测序结果表明均为CSFV E2基因片段。本研究成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测,为CSF的早期检测诊断提供了特异、灵敏的方法。     

基于Erns基因的猪瘟病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪瘟病毒Erns基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪瘟病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对CSFV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪瘟病毒检测的灵敏性为10 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。