两种植原体的PCR检测及其体系优化

用已报道的植原体通用引物对葡萄黄化病和枣疯病植原体进行常规PCR及巢式PCR检测,并对PCR反应体系进行优化.结果表明:常规PCR扩增出了1.5 kb的特异片段,所需PCR模板DNA用量为20 ng/μL;在PCR基础上的巢式 PCR扩增出1.2 kb的特异片段,所需PCR模板DNA用量为2 pg/μL.检测灵敏度提高约10 000倍.优化试验表明:25 μL反应体系中,MgCl2用量对扩增效果影响最大.最终最佳反应体系确立为:25 mM MgCl21.7 μL,2.5 mM dNTP 1.8 μL,5U/μL Taq酶可选用0.2 μL,10mM引物对各0.2 μL,最佳退火温度为45.0℃.     

小麦蓝矮病植原体的分子生物学检测研究

小麦蓝矮病是中国北方小麦的重要病害。利用植原体特异引物对小麦蓝矮病带病植株总DNA进行巢式-PCR(Nested-PCR)扩增,获得1.2kb的特异性片段,从分子水平上证明小麦蓝矮病是一种植原体病害。对具有红矮和蓝矮症状的病株扩增均可扩增出目标片段,说明红矮和蓝矮症状都是由植原体引起。试验为在小麦蓝矮病分子诊断、田间介体带毒检测、寄主范围研究等提供一种快速、灵敏可靠的方法。     

泡桐丛枝病病树周围几种植物上植原体的分子检测

 【目的】初步明确自然条件下可能感染泡桐丛枝病植原体的寄主植物。【方法】用植原体16S rRNA基因的通用引物,对从泡桐丛枝病病树周围采集的表现黄化、小叶、皱叶、丛枝等症状或无症状的16种植物样品的DNA进行巢式PCR扩增,对所扩增的片段进行序列测定和分析。并利用泡桐从枝病植原体延伸因子的抗血清对部分样品进行间接免疫荧光观察。【结果】巢式PCR结果显示从牛筋草（Eleusine indica）、辣椒（Capsicum annuum）、狗尾草（Setaria viridis）、山药（Dioscorea opposita）、灯笼泡（Physalis angulata）、花生（Arachis hypogaea）及南瓜（Cucurbita moschata）共7种植物样品和阳性对照PaWB菏泽分离物（PaWB-HZ）中均得到了约1.2 kb的特异性片段。序列分析表明这7种植原体分离物和PaWB-HZ属于翠菊黄化组的16SrI- D亚组。对所采集的植原体侵染的寄主植株辣椒、山药、花生、南瓜和泡桐进行间接免疫荧光观察结果显示,仅在PaWB-HZ侵染的泡桐中发现翠绿色特异荧光,在健康泡桐及其它4种分离物侵染的植物中均未检测到明显的植原体特异荧光。【结论】首次从泡桐丛枝病病树周围存在的7种其它植物中检测到植原体,并且测定其植原体16S rDNA核苷酸序列与泡桐丛枝植原体相关基因片段高度同源,初步推测这7种植物可能是泡桐丛枝病植原体自然寄主或是通过昆虫偶尔被感染。     

小麦3种病毒病BSMV、BYDV-PAV、WYMV及WBD植原体病害的多重PCR同步检测

 【目的】通过对检测小麦病毒病和植原体病害的多重PCR体系各成分和循环参数进行摸索和优化,建立了一种同时检测大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）、大麦黄矮病毒PAV株系（barley yellow dwarf virus,BYDV-PAV）、小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus,WYMV）和小麦蓝矮植原体（wheat blue dwarf,WBD）的多重PCR技术体系。【方法】运用根据3种病毒核苷酸保守区序列设计的特异性引物对、根据WBD植原体核糖体蛋白基因序列设计特异性引物对rpF1/R1,从影响多重PCR（M-PCR）扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重PCR体系的优化。【结果】成功的在一个体系中对BSMV、BYDV-PAV、WYMV和WBD复合侵染的小麦材料进行多重PCR扩增,得到503、600、898、1 240 bp 4条特异性大小与试验设计相符的条带,建立了同时检测4种病原的多重PCR体系。【结论】该体系实现了植原体DNA病原和病毒RNA病原的同时检测,体现了多重PCR的优越性。     

许昌泡桐丛枝病植原体的分子鉴定

对采自河南许昌的表现丛枝症状的泡桐样品进行了病原鉴定,并通过序列同源性分析确定了其分类地位。采用16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的通用引物fTufu/rTufu,对样品总DNA进行PCR扩增,分别得到了约1.2kb和840bp的特异条带。经克隆测序,并在NCBI网站比对分析,确定所得序列分别为植原体特定的16SrDNA和tuf基因序列。将测得序列与已报道的翠菊黄化组植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,显示河南许昌的泡桐丛枝病植原体属于16SrⅠ-D亚组。     

小麦蓝矮病植原体的寄主范围研究

小麦蓝矮病是陕西乃至西北冬麦区的一个重要病害,由介体条沙叶蝉专化性传播。利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1,应用PCR技术从小麦蓝矮病株叶片中扩增到1.4kb的特异片段。通过介体条沙叶蝉对小麦蓝矮病植原体寄主范围进行研究,在接种的18种寄主植物中,有8种寄主表现症状,表明小麦蓝矮病植原体寄主范围广泛。     

重庆北碚桑树萎缩病植原体分子鉴定

运用16S rDNA基因分子检测技术,使用16m F2/R16mR1,R16F2n/R16R2引物对扩增采集于重庆北碚地区表现萎缩病症的桑叶样品的总DNA,结果发现在编号为C,I,S的样品中扩增出了约1.2 kb的特异条带.经克隆测序并通过NCBI比对分析后,确定所得序列为植原体的特定序列16S rDNA,将测序结果与已报道的桑树萎缩病植原体序列进行同源性比对,结果表明重庆北碚地区桑树萎缩病植原体均属于16S r I亚组,其中C样品中萎缩病植原体鉴定为B亚组.研究结果为明确北碚地区桑树萎缩病病原及该病害的有效防治提供了基础依据.     

耿马甘蔗白叶病植原体昆虫介体调查与检测

为探明云南蔗区甘蔗白叶病植原体的昆虫介体及优势种群,丰富甘蔗植原体病害相关理论和技术基础,制定适用于甘蔗白叶病的综合防控措施,2019年采用寻集法和扫网法对甘蔗白叶病发病最为严重的云南省临沧市耿马蔗区进行甘蔗白叶病植原体昆虫介体调查和巢式PCR检测分析。调查检测结果显示,采集到的大青叶蝉(Tettigoniella viridis)和条纹平冠沫蝉(Clovia conifer)2种昆虫介体均被检测为阳性,是甘蔗白叶病植原体的自然携带者,说明2种叶蝉可能为甘蔗白叶病植原体潜在昆虫介体;大青叶蝉若虫呈强阳性,初步确定为优势种群。鉴于目前云南蔗区甘蔗白叶病植原体传播方式主要是带毒蔗种和叶蝉类昆虫介体,建议建立甘蔗无病健康种苗繁育基地,及时杀灭蔗园中叶蝉类昆虫介体,从源头上控制甘蔗白叶病的扩散蔓延,降低田间自然传播速度。     

周年温度变化对泡桐丛枝病植原体分布和消长的影响

为探讨温度变化对泡桐树体内丛枝病植原体分布和消长的影响,利用巢式PCR和直接PCR研究了植原体在泡桐不同器官内的分布及相对含量的周年变化。结果表明,不同发病程度泡桐中丛枝病植原体的分布不同,发病程度相同泡桐不同器官内植原体含量也存在一定差异。在中等发病程度的泡桐中,丛枝病植原体全年存在于枝条内,并且其含量随温度升高逐渐升高,8月份达到最高,此后开始下降;叶片内植原体含量随温度升高明显增加,7月份含量最高,随后减少,10月份降到最低;根部植原体含量随温度升高也相应增加,在9月份达到最高,之后开始降低,全年含量变化较小,且含量最高值较叶片和枝条中低。表明泡桐丛枝病植原体在寄主体内的消长与温度的周年变化关系紧密。     

大连枣树丛植病病原鉴定

针对辽宁大连地区首次发现的枣树丛枝病病原进行了鉴定,利用植原体16S rDNA通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对枣疯病(jujube witches’- broom phytoplasma,JWB - DL)植株总DNA进行巢式PCR扩增,并且通过软件pDRAW32进行RFLP电子酶切,根据分析结果构建系统发育树.结果表明,该病原序列与榆树黄花组( 16SrV)中的各亚组植原体同源率为99％以上,其中与16S rV -B亚组樱桃致死黄化(Cherry lethal yellow,CLY)同源性高达100％,而与其他组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于96％,由此推断引起大连枣树丛枝病的为16SrV-B亚组的枣疯病植原体.     

绵羊早期胚胎性别鉴定巢式PCR体系的建立及其灵敏度研究

根据绵羊SRY(sex determining region of the Y)基因的723 bp的高度保守序列设计跨度为193 bp的两对巢式雄性特异引物,同时根据绵羊β-B-珠蛋白基因设计跨度为278 bp的两对巢式引物为内标引物,通过析因设计法建立了巢式PCR体系,对公、母羊肝组织基因组进行巢式PCR扩增,经1.5%的琼脂糖电泳检测,公羊同时出现278 bp的β-B-珠蛋白基因扩增带和193 bp的雄性特异扩增带两条带,而母羊只扩增出278 bp常染色体基因序列扩增带.用此巢式PCR体系扩增淋巴细胞,灵敏度≥10 pg DNA(约3个细胞),鉴定全程不超过130 min.     

水稻橙叶病PCR检测体系的建立

利用植原体通用引物sP1和sP2,采用PCR法从发病的水稻植株中扩增植原体一段保守的16S rRNA基因的核苷酸序列. 结果表明,从发病的水稻植株中都能够稳定扩增得到1条558 bp的特异性条带. 对该条带进行克隆和序列分析表明,该片段和Genbank中公布的众多植原体的相应区域的核苷酸序列相似性都高达95%以上,表明利用植原体通用引物能有效扩增得到水稻橙叶病原的序列. 利用此引物并优化PCR反应条件,建立了水稻橙叶病的PCR检测方法. 该方法对检测水稻橙叶病具有特异、灵敏和有效性. 应用该检测体系检测从广东信宜、高州和从化采集的多份疑似标样,结果表明,在这几个地区均有水稻橙叶病的发生和危害.     

差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA

为了解枣疯病植原体的分子特征,明确植原体的致病机理及其与寄主的互作关系,以枣疯病组培苗为材料,利用差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA。结果表明:感病组培苗在1600²200 kb之间出现一条明亮的条带,而健康组培苗没有,回收后经PCR检测,证明该目的条带是植原体DNA,实时定量PCR的分离结果表明:该实验方法能有效地将植原体基因组和植物基因组分离。     

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白（Imp）基因的克隆和分子特性分析

 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp 1051/Imp 2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0 kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495 bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4％和95.1％。蛋白质结构分析结果表明：小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。     

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

[目的]对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定.[方法]通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段.将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析.[结果]苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高.[结论]苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员.     

利用巢式PCR检测花生青枯病菌

为建立花生青枯病菌的快速检测技术,本研究利用细菌16S-23SrDNA内源转录间隔区(ITS)通用引物L1/L2扩增花生青枯病菌基因组DNA并对其扩增序列进行克隆测序,通过与其同属近缘种做比较,设计1对特异性引物W1/W2,利用该对引物与细菌通用引物L1/L2建立了花生青枯病菌的巢式PCR检测方法。结果显示,引物W1/W2只能从花生青枯病菌中扩增出374bp的特异片段;巢式PCR检测灵敏度可达10fg·μL-1基因组DNA,较常规PCR提高1000倍;该技术可用于花生青枯感病期或者发病潜伏期时的病害检测。     

差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA

为了解枣疯病植原体的分子特征,明确植原体的致病机理及其与寄主的互作关系,以枣疯病组培苗为材料,利用差速离心结合脉冲电泳分离枣疯病植原体DNA。结果表明:感病组培苗在1600~2200 kb之间出现一条明亮的条带,而健康组培苗没有,回收后经PCR检测,证明该目的条带是植原体DNA,实时定量PCR的分离结果表明:该实验方法能有效地将植原体基因组和植物基因组分离。     

犬细小病毒巢式PCR诊断方法的建立及应用

[目的]以期建立犬细小病毒巢式PCR诊断方法.[方法]根据基因库已发表的CPV VP2基因序列设计二对巢式引物,以临床上疑似CPV感染的犬粪样品中提取的总DNA作为模板,用巢式PCR方法扩增出CPV VP2基因的目的条带.[结果]扩增出的目的基因与国际标准序列的同源性为99.3;～ 100;.特异性试验发现该引物不能启动犬其它常见病毒基因的扩增.敏感性试验表明该引物能检测到10-9的CPV总RNA量.重复性试验显示该引物具有良好的稳定性.对采集的26份样品进行CPV巢式PCR检测,20份样品为阳性,阳性率为76.9;.[结论]建立的CPV的RT - PCR检测方法可于临床CPV的快速诊断和小规模的分子流行病学调查.     

多重PCR快速检测槟榔黄化植原体和槟榔隐症病毒1体系的建立

由槟榔黄化植原体(arecapalmyellowleafphytoplasma,AYLP)引起的黄化病和槟榔隐症病毒1(Areca palm velarivirus 1, APV1)引起的黄叶病毒病是危害槟榔树最严重的两种病害,对海南槟榔产业造成了巨大的经济损失,建立快速的检测技术对于两种病害的预警防控具有重要意义。利用多重PCR(Multiplex PCR)技术同时检测AYLP和APV1,即AYLP巢式PCR第一轮结束后,再使用一次多重PCR对两种病原同时进行扩增,最后进行电泳观察结果。结果显示,通过对多重PCR浓度体系和退火温度进行优化,在一个体系中成功扩增出AYLP和APV1,得到525和311 bp两条特异性大小条带。多重PCR检测与单一PCR检测结果完全一致,并且与单一PCR检测方法比较,多重PCR方法精简了操作步骤,提高了检测效率,显著降低了检测成本,为槟榔黄化病和黄叶病毒病的常规诊断提供了新方法。因此,该技术在AYLP和APV1常规检测中具有重要的应用价值。     

梨轮纹病和炭疽病病原菌PCR检测

为建立梨轮纹病原菌和炭疽病病原菌的分子检测方法,根据GenBank上炭疽病原菌和轮纹病原菌不同种的ITS序列差异设计2对引物TJ1/TJ2和LW1/LW2,对2种病原菌菌株进行扩增,比较了常规PCR和巢式PCR的检测灵敏度,并对果园中接种梨轮纹病原菌的梨果实进行检测。结果表明,建立的PCR体系可分别从炭疽病原菌和轮纹病原菌菌株扩增出317 bp和325 bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带。巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍,且可以在接种较低浓度(1 ml 10个)轮纹病原菌孢子液7 d后的梨果实组织中检测到病原菌。说明使用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病原菌在果园的种群消长动态。