检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。     

猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和3型三重PCR检测方法的建立

为了建立能够同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)单一或混合感染的PCR检测方法,参考GenBank中PRV gE基因、PCV2和PCV3全基因序列,针对PRV gE、PCV2 Rep和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0设计3对特异性引物,随后对其...     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。     

猪伪狂犬病毒野毒感染的PCR检测方法建立及应用

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、gB基因序列,设计并合成了2对特异性引物,以PRV容A株细胞培养毒为模板,通过对PCR扩增条件的优化,建立了区分PRV野毒株和疫苗毒株的双重PCR方法。该方法能从野毒株基因组中同时扩增出2条大小分别为400bp(gE基因)、582bp(gB基因)的特异性片段,从疫苗毒DNA中仅扩增出1条大小为582bp的片段。试验证明所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,对临床上20份PRV感染疑似病料进行检测,双重PCR检测的结果与单重PCR检测结果总体符合率为100%,表明所建立的双重PCR检测方法可用于猪伪狂犬病野毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的检测

为了检测猪伪狂犬病病毒和猪博卡病毒混合感染的情况,研究建立了快速,简便,灵敏度高,特异性强的鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪博卡病毒(PBoV)的双重检测方法。针对PRV gE基因和PBoV NS1基因的序列,分别设计了2对特异性引物,通过对引物浓度、模板加入量、退火温度等的优化,建立了快速鉴别PRV和PBoV的双重PCR检测方法,并进行了特异性和敏感性试验。特异性试验表明,该方法可以扩增出PRV gE长度为316 bp和PBoV NS1长度为996 bp的目的片段,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪捷申病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无扩增;敏感性试验表明,PRV、PBoV的最低核酸检出量分别为6.44×10~2拷贝和9.51×10~3拷贝,与单一PCR敏感性相同。应用该方法对49份送检病料样品进行检测,其中PRV和PBoV的单纯感染检出率分别为34.69%和14.28%,混合感染检出率为8.16%,与单一PCR检测结果符合率为93.88%。     

PCR结合核酸斑点杂交检测猪伪狂犬病毒

本研究基于猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)gE基因,建立了一种PCR结合核酸斑点杂交检测方法来鉴别野毒株和疫苗株,并利用这一方法对山东省部分地区的猪临床病料中PRV进行了检测。结果显示,建立的PCR结合核酸斑点杂交检测方法只与PRV野毒株反应,而与PRV gE基因缺失疫苗、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒2型不反应。PCR结合核酸斑点杂交方法在53份病料中检出PRV阳性病料5份,阳性率为9.43%,高于单纯PCR的检出率(7.55%)。结果表明,本研究建立的PCR结合斑点杂交的方法特异性强,灵敏度高,适合PRV野毒的检测以及流行病学调查,可应用于PRV的鉴别诊断和净化。     

一例多种病毒混合感染的实验室诊断及综合防制措施

2016年3月,彭州某猪场出现疑似猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)混合感染严重疫情,猪群发病率和死亡率较高。为进一步确诊和提供科学的防控依据,采集10头繁殖障碍母猪(未曾注射PRRSV疫苗)血样,用IDEXX试剂盒进行猪瘟病毒(CSFV)、PRRSV和PRVgE抗体检测。同时采集2头流产胎儿(对应2头流产母猪)组织分别进行CSFV、PRRSV的RT-PCR检测和PRV gE的PCR检测,采集2头腹泻同时伴随神经症状的仔猪组织进行TGEV、PEDV、猪轮状病毒(RV)的RT-PCR检测和PRV gE的PCR检测。结果显示,母猪CSFV抗体阳性率达90%,对应流产胎儿未检出CSFV,表明无CSFV感染,免疫合格;PRRSV和PRV gE抗体阳性率达100%,对应流产胎儿均测出PRRSV和PRV,表明这两种病毒感染情况严重;2头仔猪PCR和RT-PCR结果提示均有PRV、PEDV和TGEV野毒感染,并根据以上检测结果提出紧急防控措施。     

鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒与野毒套式PCR方法的建立

为建立一种能够鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒与野毒套式PCR方法,根据GenBank上发表的伪狂犬病毒gD、gE基因序列,设计并合成了4对引物,对反应体系和条件进行优化,建立复合套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料中PRV检测对比等方法验证建立方法的适用性。结果表明,该方法检测的极限为2.78×10~(-4)pg/L,并且仅能从PRV野毒株扩增出354、217 bp目的条带,PRV疫苗扩增出了217bp单条带,其他5种常见感染猪的病毒均为阴性。     

猪伪狂犬病病毒疑似感染人的实验室诊断及分析

为给人感染伪狂犬病病毒(PRV)来源分析及其感染机理研究提供相关信息，对一例疑似感染PRV患者的血清、脑脊液、拭子及其工作猪场的病猪血清、组织等样品进行病原学、血清学检测及病毒分离，对其工作猪场开展流行病学调查，并采集患者同事血清样品进行PRV抗体检测。结果显示：病人样品经数字PCR检测均为PRV核酸阳性；病人发病后5～90 d内的血清样品均为PRV gB抗体阳性，gE抗体发病后18 d转为阳性并一直持续到发病后90 d；病人同事均未表现临床症状，其血清样品PRV gB抗体阳性率为22.2%,gE抗体均为阴性；从病人工作猪场的病猪样品中分离到PRV，且样品经荧光定量PCR核酸检测及ELISA抗体检测均检出阳性；病人工作猪场为PRV阳性场，病人及PRV gB抗体阳性同事均有直接接触病猪史。结果表明，患者感染的PRV来自其工作猪场猪群的可能性较大，人感染后表现出和动物感染相似的抗体消长规律。PRV对公共卫生的影响及其感染机制需进一步关注和研究。     

检测伪狂犬病病毒的SYBR Green实时荧光定量PCR方法的建立

伪狂犬病病毒（PRV）是严重影响养猪业发展的重要病毒，病毒粒子具有较强的抵抗力。SYBRGreen是结合于双链DNA的荧光染料，可在定量PCR反应时与双链PCR产物结合放出荧光信号，被仪器系统实时监控并检测。目前SYBRGreen荧光定量PCR方法在遗传性疾病的诊断等方面有重要的应用价值。本研究根据编码PRV最保守的基因之一的gB基因和PRV的主要毒力基因，即标志性疫苗缺失的gE基因核酸序列设计引物，以含有gE基因的重组质粒ppgE作外部参照，建立了gB和gESYBR Green PCR方法，研究了该方法的灵敏度、特异性以及重复性，现将结果报告如下。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRV gD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数（R²）分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。     

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列,分别设计了2对特异性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A,产物分别为270 bp和189 bp。检测结果显示,该方法具有较高特异性,检测PRV和PCV-2的DNA最低量均为1×10~(-4)μg/μL。对136份临床上疑似为PRV和PCV-2感染病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床上PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的传染病病原学诊断。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测.结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应.本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测.     

伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒双重RPA鉴别检测方法的建立和应用

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒和疫苗毒的快速鉴别检测方法,本研究基于PRV gB和gE基因保守区域设计引物,建立了一种双重重组酶聚合酶扩增方法(RPA)。本研究所建立的双重RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20min,能够在同一个反应体系中实现对PRV野毒和疫苗毒的特异性鉴别检测,而与其它常见的猪病毒没有交叉反应。所建立的双重RPA方法对PRV gB和gE基因的检测限均为102拷贝,并且与荧光定量PCR方法检测限一致。通过对4株不同PRV株和37份临床样品的检测,结果表明双重RPA方法能够实现对不同PRV株的检测,对临床样品中PRV gB和gE基因的检出率均为45.9%(17/37),与荧光定量PCR方法检测的符合率为100%。本研究所建立的双重RPA方法反应快速、操作简便、结果可靠,可有效应用于对PRV野毒和疫苗毒的快速鉴别检测。     

应用荧光定量PCR方法检测伪狂犬病病毒弱毒株在猪体组织中的分布

为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为10¹拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。     

猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测Ⅱ．JEV、PPV、PRRSV、PRV单项PCR检测方法的建立

在利用计算机设计出检测流行性乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）的多联PCR引物的基础上，分别进行各单项PCR检测相应病毒试验，确定了各单项PCR反应条件范围，并对各PCR扩增产物进行了点杂交和部分测鉴定。用单项PCR对感染猪相关病毒的检测证实，本试验已经建立了有效、特异、敏感的检测JEV、PPV、PRRSV、PRV的单项PCR技术，为进一步建立多联PCR技术及其应用打下了基础。     

广东某猪场伪狂犬病病毒GD2013株的分离鉴定

本研究于2013年3月在广东某猪场采集疑似伪狂犬病(PR)的猪脑组织。对脑组织进行病毒分离,通过透射电镜观察及PCR扩增gB和gE基因,并进行序列测定。结果表明,透射电镜显示该病毒粒子具有典型的疱疹病毒结构,PCR可以扩增出伪狂犬病病毒(PRV)gB和gE基因,经序列分析和生物学特性鉴定,证实该分离病毒株为我国近几年流行的PRV变异株,并将其命名为PRV-GD2013。小鼠致病性试验表现出典型的PR症状。通过以上实验可以确定该猪场感染病原为PRV。