二化螟味觉受体基因鉴定、克隆与表达模式分析

【背景】二化螟(Chilo suppressalis)是我国水稻上的重要害虫之一,味觉受体(gustatory receptor,GR)基因在昆虫取食、产卵等过程中发挥重要作用。【目的】基于组学数据鉴定并克隆二化螟GR基因序列,明确其在不同发育阶段和成虫不同组织中的表达特性,为后续深入研究二化螟GR基因的功能打下基础。【方法】结合二化螟转录组数据和其他昆虫的GR基因序列,通过多重序列比对,鉴定二化螟GR基因。利用RT-PCR方法克隆获得二化螟GR基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,运用生物信息学分析工具对二化螟GR基因编码的氨基酸序列进行分子生物学特征、结构域等分析;基于最大似然法构建二化螟GR基因蛋白序列与其他昆虫GR基因的系统进化树;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析GR基因在二化螟不同发育阶段(1—6龄幼虫和雌、雄成虫)和成虫不同组织(雌、雄成虫的触角、头、翅、腹、足)中的表达模式。【结果】鉴定并克隆得到5个二化螟GR基因,分别命名为CsupGR1—5,ORF长度为1 122—1 428 bp,编码氨基酸序列长度为373—475...     

Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

青杨天牛触角味觉受体基因的鉴定

[目的]鉴定青杨天牛(Saperda populnea)触角味觉受体基因的种类。[方法]根据青杨天牛触角总RNA的转录组测序结果,结合生物信息学分析方法对其味觉基因进行鉴定,并采用RT-PCR技术测定味觉受体基因在不同组织中的表达量。[结果]共鉴定出青杨天牛味觉受体基因11种,其中4种全长味觉受体基因(SpopGR1、SpopGR3、SpopGR4、SpopGR5)在青杨天牛雌雄触角均有表达,除SpopGR5,另外3个基因均在足表达,SpopGR1和SpopGR4在雌触角、雄触角、头、胸、腹、足和翅这7个部位均有表达,但表达量偏低。[结论]通过与果蝇味觉受体基因建树分析,推测SpopGR7、SpopGR9、SpopGR10可能属于苦味受体家族,行使对苦味的感知功能。该研究有助于在分子水平上加深对昆虫味觉感知系统的理解,为以后采用化学生态手段对青杨天牛进行调控提供依据。     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Bta4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析。获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2090bp,其开放阅读框编码564个氨基酸。根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Bta4（GenBank注册号为EF590120）。Bta4编码的α亚基含有2个结构域：N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸（α亚基特征序列）、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区。研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义。     

大灰象甲非典型气味受体基因SvelOrco的克隆及组织表达谱分析

旨在克隆大灰象甲Sympiezomias velatus的Orco基因,明确其分子特征及其组织表达谱。通过分析成虫触角转录组数据并利用RT-PCR克隆出大灰象甲Orco基因,对大灰象甲Orco蛋白进行结构分析和系统发育分析,并采用qPCR测定Orco基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达量。克隆获得大灰象甲Orco基因并命名为SvelOrco(GenBank登录号：OM417062),其开放阅读框长1 449 bp,编码482个氨基酸。预测SvelOrco蛋白的分子质量为53.49 ku,等电点为5.66,主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,有7个跨膜结构域。系统发育分析表明大灰象甲与云杉八齿小蠹Ips typographus亲缘关系最近。qPCR结果显示：SvelOrco主要在大灰象甲成虫触角上表达,雄虫触角表达量最高,是雌虫触角表达量的1.22倍,SvelOrco在翅部也有少量表达,在头、胸、腹和足的表达量极低。     

烟粉虱溶菌酶基因的鉴定及表达分析

【目的】鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的溶菌酶基因,并对其序列特征、进化关系和表达模式进行分析,探索该基因在烟粉虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用,为进一步解析烟粉虱先天免疫过程提供理论依据。【方法】以第2代高通量测序的结果为依据,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值＜10^-5的基因为烟粉虱溶菌酶基因（lysozyme gene of Bemisia tabaci,BtLyz）,利用ORF Finder预测BtLyz的开放阅读框,并得到氨基酸序列;利用Pfam和SMART预测BtLyz的蛋白质结构域;利用SinglP 4.1 Server预测BtLyz序列的信号肽;利用MEGA6.0软件进行BtLyz的氨基酸多序列比对;利用MEGA6.0软件,对BtLyz与其他昆虫的31个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用邻接法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析球孢白僵菌侵染烟粉虱卵、若虫、成虫后,在12、24、36、48、60 h时目标基因的时空表达模式。【结果】鉴定出烟粉虱4个溶菌酶基因,分别命名为BtLyz1、BtLyz2、BtLyz3和BtLyz4,基因序列全长分别为1 819、1 149、829和928 nt,分别编码159、160、148和160个氨基酸,且均含有信号肽。蛋白质结构分析、氨基酸序列比对和系统进化分析发现,BtLyz1和BtLyz4属于i型溶菌酶,BtLyz2和BtLyz3属于c型溶菌酶。BtLyz-1与豌豆长管蚜ApLyz-i1位于同一进化支上,BtLyz4与柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆长管蚜ApLyz-i2位于同一进化支上。BtLyz2和BtLyz3与褐飞虱NlLyz-c1和异色瓢虫HaLyz-c3位于同一进化支上。与对照相比,卵期4个溶菌酶基因和若虫期BtLyz4的相对表达量没有显著变化;若虫期BtLyz1的相对表达量先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,24 h时上调表达最明显,为对照组的4.55倍;成虫期BtLyz1和BtLyz4的相对表达量均为先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,60 h时上调表达最明显,为对照组的11.31和4.21倍;若虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调表达,在诱导24 h时上调表达最明显,为对照组的5.09和8.31倍,而后急剧下调,在60 h时下调表达最明显,为对照组的0.19和0.13倍;成虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调的表达趋势,在24 h时上调最明显,为对照组的5.56和8.84倍。【结论】从烟粉虱体内鉴定了4个溶菌酶基因序列,其中2个为c型溶菌酶序列,2个为i型溶菌酶序列;在球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态、不同时间后,卵期的相对表达量与对照相比没有显著变化;在若虫和成虫期,不同BtLyzs表现出不同的表达趋势。4个BtLyzs可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生物防治的潜在新靶标。     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Btα4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析.获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2 090 bp,其开放阅读框编码564个氨基酸.根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Btα4(GenBank注册号为EF590120).Btα4编码的α亚基含有2个结构域:N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸(α亚基特征序列)、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区.研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义.     

芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因(MiETR1和MiERS1),并进行生物信息学分析,为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考.[方法]以芒果为材料,应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列,并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析.[结果]克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp,开放阅读框(ORF)2220 bp,编码739个氨基酸;MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp,ORF 1890 bp,编码629个氨基酸;GenBank登录号分别为KY002681和KY002682.MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白,属于乙烯受体ETR1家族成员,以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导,均含有3个典型的模块,即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域,MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域.不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性,MiETR1和MiERS1均与甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Cit-rus clementina)的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近,但二者分别聚在两个不同的分支上,表明两个蛋白存在一定的遗传分化.[结论]乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用.     

灰飞虱actin基因的克隆及原核表达

通过生物信息学分析获得了灰飞虱actin基因的序列信息,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆了actin基因的开放阅读框,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。序列分析结果表明,该基因开放阅读框长1 131 bp,编码377个氨基酸,蛋白质理论分子量为4.17×104,理论等电点为5.28。将此序列登录GenBank数据库,登录号为KC683802。序列比对发现,该基因序列在多个物种间保守,与褐飞虱actin基因的同源性高达95%。构建的原核表达载体pET32a-actin,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行获得表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达的蛋白质主要存在于包涵体中。     

荔枝椿平腹小蜂触角味觉受体基因的鉴定与表达分析

昆虫具有极其敏锐的味觉感受系统,昆虫的味觉系统对其取食选择、交配和产卵等多种行为反应起到重要的作用。荔枝椿平腹小蜂(Anastatus japonicus)作为膜翅目中一种重要的寄生蜂,具有防治荔枝椿象的作用。研究对荔枝椿平腹小蜂触角进行转录组测序,从数据库进行筛选鉴定得到5个味觉受体基因。借助RT-PCR对荔枝椿平腹小蜂的雌性触角、雄性触角、胸、腹和腿部味觉受体的表达量进行比较,发现Ajap GR58,Ajap GR49和Ajap GR64f在成虫的各组织部位表达量一致并均较低,而Ajap GR38和Ajap GR2的表达量相对较高,同时,Ajap GR38只在雌性触角以及胸部特异性表达,Ajap GR2则是在雌性触角、雄性触角、胸部和腹部均有表达,而腿部却不表达。通过系统发育树可以看出,Ajap GR58和Ajap GR49同源,与DmelGR33a,Dmel GR43a聚在一起,Ajap GR38与Dmel GR28同源,与Dmel GR66a聚在一起,说明Ajap GR58、Ajap GR49以及Ajap GR38处于苦味受体家族中,可能也行使苦味感知功能。Ajap GR64f与Dme GRl5,DmelGR64f同源并与Dmel GR64a聚在一起,同时,Ajap GR2与Dmel GR64a,Dmel GR64b,Dmel GR64c,Dmel GR64f以及Dmel GR5所形成的一类并聚在一起,说明Ajap GR64f和Ajap GR2处于甜味受体家族中,可能也行使甜味感知功能。     

福建省烟粉虱生物型鉴定

采用m tDNA分子标记技术以及西葫芦银叶测定方法,对从福建省8个具有代表性地理区域采集的烟粉虱样品进行生物型鉴定.结果表明:8个烟粉虱种群在m tDNA COⅠ基因720 bp片段序列上的所有位点都相同,它们与Texas-B、Israel-B、Ind ia-B、Morocco-B、France-B1、France-B2、Be ijing-B、Argentina-B、Reun ion-B1、Reun ion-B2、Reun ion-B3等11个B型烟粉虱种群在m tDNA COⅠ基因720 bp序列上的差异很小(序列相似性为99.6%-100%),总体上属于同一进化枝;与Morocco-Q、Colomb ia-A1、Colomb ia-A2烟粉虱种群在m tDNA COⅠ基因720 bp序列上差异较大,分别属于不同的进化枝;8个烟粉虱种群均可引起典型的西葫芦银叶症状.说明福建省8个烟粉虱种群均属于B生物型.     

烟粉虱的为害及其生物防治策略

综述了烟粉虱Bem isia tabaci(Gennad ius)的为害状况及其生物防治研究进展,包括寄生蜂、捕食性天敌的保护、利用和引进,以及寄生真菌的利用.根据烟粉虱的为害特点,探讨了目前烟粉虱生物防治的策略以及存在的一些问题.     

亚洲玉米螟两种漆酶基因OfLac1和OfLac2 cDNA 的克隆及基因表达

【目的】克隆亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）漆酶-1（OfLac1）和漆酶-2（OfLac2）基因;研究OfLac1和OfLac2在亚洲玉米螟不同发育阶段和不同组织中的表达特异性;分析蜕皮激素处理亚洲玉米螟后OfLac1和OfLac2基因表达量的变化;比较OfLac1和OfLac2表达模式的差别,推测其生理功能。【方法】根据已知的其他昆虫中Lac-1和Lac-2的保守氨基酸序列分别设计引物,以亚洲玉米螟白蛹时期提取的RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增OfLac1和OfLac2的保守区。然后根据所得的保守区片段分别设计基因特异性引物,采用RACE方法分别克隆OfLac1和OfLac2的3′和5′端序列,通过拼接获得OfLac1和OfLac2的基因全长。收集5龄第4天亚洲玉米螟的表皮、中肠、脂肪体、丝腺、气管、马氏管、精巢7种不同组织材料,通过半定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同组织中的基因表达模式。收集从卵到成虫29个不同生长发育时期的亚洲玉米螟作为材料,采用实时荧光定量PCR分析OfLac1和OfLac2在不同发育时期的基因表达水平。选取5龄第2天亚洲玉米螟幼虫进行蜕皮激素注射,分别在1、4、8、12和24 h后取样,利用实时荧光定量PCR研究OfLac1和OfLac2在蜕皮激素诱导下的基因表达水平。【结果】克隆获得亚洲玉米螟OfLac1和OfLac2的 cDNA序列。OfLac1全长3 065 bp,其中5′非编码区222 bp,3′非编码区440 bp,开放阅读框2 403 bp,共编码800个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为90.6 kD,理论等电点pI为5.34;OfLac2全长3 405 bp,其中5′非编码区162 bp,3′非编码区960 bp,开放阅读框2 283bp,共编码760个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为84.0 kD,理论等电点pI为6.43。通过SignalP分析发现,OfLac1在N端包含一个长为22个氨基酸的信号肽,OfLac2在N端包含一个长为23个氨基酸的信号肽,均为分泌蛋白质。基因表达模式分析表明,在发育过程中,OfLac1主要在成虫中表达,在其他发育时期表达量较低;OfLac2在每个幼虫龄期的末期表达水平上调,在幼虫化蛹过程中的预蛹期表达量最高;在不同组织中,OfLac1在马氏管和中肠中表达量最高,在气管和表皮中的表达量较低,在精巢、丝腺和脂肪体中几乎不表达;OfLac2在中肠和丝腺中表达量最高,在气管和表皮中的表达量较低,在精巢、马氏管和脂肪体中几乎检测不到表达。将蜕皮激素20E注射到亚洲玉米螟体内,OfLac1在注射24 h后表达量明显上调,OfLac2在注射12 h后表达量开始上调,在24 h后上调最明显。【结论】克隆得到亚洲玉米螟两种漆酶OfLac1和OfLac2的cDNA序列。两种漆酶基因的表达模式存在明显差别,但都受蜕皮激素的调控。OfLac2可能参与蜕皮过程表皮褐化。     

上海地区烟粉虱生物型的鉴定

烟粉虱是一种由许多生物型组成的复合种,是一种世界性的重要害虫.不同生物型的烟粉虱在寄主范围、传毒能力、抗药性等许多生物学特性方面存在差异.利用mtDNA COI基因作标记对上海地区的烟粉虱生物型进行了分析鉴定.结果表明,所测上海10个代表性地区中,闵行区只检测到B型烟粉虱,嘉定、青浦和徐汇区只检测到Q型烟粉虱,其余各地区B型和Q型两种生物型烟粉虱共存.所测上海地区共45个种群中,有31个种群为Q型,占所测种群的68.9％,14个种群为R型,占31.1％.而且,大棚采集种群多为Q型(Q型占87.0％).结果说明Q型烟粉虱已在上海地区广泛存在、大量发生,并有取代R型烟粉虱成为上海地区烟粉虱主要危害类型的可能.     

长沙市烟粉虱的种群动态及生物型

2009-2010年,对长沙市烟粉虱的种群动态进行了调查,发现长沙市烟粉虱的种群发生呈现出2个高峰,分别在5-6月和9月.通过线粒体细胞色素氧化酶I(COI)区段基因的测序,对长沙烟粉虱的生物型进行鉴定,确定长沙烟粉虱的生物型为Q型.     

烟粉虱在夏季番茄植株上的分布

对烟粉虱各虫态在番茄不同叶位层的分布调查结果显示,烟粉虱各虫态在番茄植株各部位均有分布,但分布极不均匀。卵、若虫主要集中分布在番茄的中部,而成虫主要集中分布在番茄的中部偏上。夏季番茄植株上调查烟粉虱卵、若虫和成虫的适宜叶位（由上往下）分别为第3～4叶、7～8叶和5～7叶,并建立了根据相关叶片上烟粉虱的数量估算整株虫量的数学模型。     

我国棉田烟粉虱研究进展

综述了烟粉虱在我国棉田的为害现状、特点,对近几年烟粉虱爆发的原因进行了分析,并提出了棉花烟粉虱的防治措施。     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。