‘红地球’葡萄花芽分化过程中的转录组分析

【目的】 葡萄是我国重要的果树树种,花芽分化直接影响葡萄的质量和数量。对‘红地球’葡萄花芽分化过程中的花芽进行比较分析,探索‘红地球’葡萄花芽分化机制,挖掘关键基因,为了解‘红地球’葡萄花芽分化提供理论基础。【方法】 对‘红地球’葡萄花芽分化过程中4个发育阶段：S1（未分化期）、S2（花原始体发育期）、S3（花序主轴发育期）和S4（花序二级轴发育期）的芽进行形态学观察和植物激素测定,并进行转录组测序分析及验证。【结果】 ‘红地球’葡萄花芽分化过程中共发现13 729个差异基因,其中S1-S2、S2-S3、S3-S4和S1-S4分别有4 158、2 050、3 425和7 652个差异基因。在S1-S4差异基因的富集调控网络中发现差异基因在激素介导的信号通路、脱落酸代谢过程、对酸性化学物质的反应和植物细胞壁组织或生物发生等通路富集。在激素介导的信号通路中发现大量与生长素、赤霉素和脱落酸等相关基因,测定表明,生长素在S2时期含量最高,而在S3和S4时期含量最低;赤霉素含量在花芽分化过程中不断降低,在S4时期为S1时期的80%;脱落酸含量在S1和S4时期较高,而在S2时期最低。此外,S1-S4差异基因来自转录因子家族（MYB、ERF、bHLH和MADS-box等）,表明这些转录因子家族基因参与了‘红地球’葡萄花芽分化。对差异表达的13个MADS-box家族基因进一步分析表明,MADS8、AGL65、AGL15、AGL12和MADS2在花芽分化进程中表达上调,而AGL30、LeMADS、FBP24、AGL14和MADS3表达下调。对这些MADS-box基因进行qRT-PCR验证,基因表达趋势与转录组数据一致且相关系数较高,表明数据分析结果可靠。【结论】 ‘红地球’葡萄花芽分化是一个复杂的生物过程,其中,植物激素介导的信号通路以及MADS-box家族基因在花芽分化中发挥重要作用。研究结果提供了一个关于转录因子、基因和激素的信息,有助于揭开这一复杂的发育过程,并为‘红地球’葡萄花芽分化综合模型的建立提供理论基础。     

‘黑比诺’葡萄不同叶龄叶片叶绿体内淀粉积累及其相关基因表达差异分析

【目的】随着叶龄的增长,葡萄叶片叶绿体内淀粉积累增加,但是调控其淀粉积累的分子机理还未见报道,本研究通过筛选参与调控淀粉积累的潜在基因,阐明葡萄不同叶龄叶片叶绿体中淀粉积累的分子机理。【方法】以2年生‘黑比诺’(Pinot Noir)葡萄为试材,观察不同叶龄叶片叶绿体内淀粉积累动态,并采用高通量测序技术进行转录组分析,筛选出与淀粉和蔗糖代谢途径相关的关键酶基因,同时采用实时荧光定量PCR技术对关键基因进行表达验证。【结果】未展开叶（NL）叶绿体内淀粉粒体积较小,积累量少,随着叶龄增长,在生长中叶（GL）和成熟叶（ML）叶绿体内,淀粉粒体积明显增大,积累量增加。转录组测序共得到58.57 GB的有效数据,KEGG富集分析表明,与NL相比,在GL和ML中差异表达的基因显著富集于淀粉与蔗糖代谢通路。分析该通路基因表达模式发现,细胞壁转化酶（cell wall invertase,CWINV）、磷酸葡萄糖变位酶（Phosphoglucomutase,PGM）、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase）等基因参与蔗糖转化为淀粉合成前体腺苷二磷酸葡萄糖（adenosine diphosphate glucose,ADPG）的过程,且随叶龄增大逐渐上调表达;可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase,SSⅠ）、淀粉分支酶（starch branching enzyme,SBE）、α-淀粉酶（α-amylase,AMY）、β-淀粉酶（β-amylase,BAM）等基因参与淀粉合成与水解过程,同样随叶龄增大上调表达,其中AGPase、SSⅠ、SBE在半结晶结构支链淀粉合成中起重要作用。【结论】随着叶龄的增大,叶绿体中淀粉积累增加;AGPase、SSⅠ、SBE等基因可能是参与调控叶绿体内淀粉积累的关键基因。     

绿僵菌黏附素MAD1体外表达及诱导花生响应的作用

【目的】绿僵菌具有昆虫致病性和植物共生性,其黏附素MAD1在绿僵菌侵染寄主昆虫过程中起重要作用。通过体外真核表达MAD1蛋白,明确MAD1在绿僵菌与植物共生中发挥的作用。【方法】以绿僵菌转录组的Unigenes作为参考序列,在GenBank中进行同源性检索比对,设计引物,以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）IPPM010202菌株的cDNA作为模板,克隆得到mad1,通过DNAMAN对mad1序列进行蛋白翻译,利用ProtParam在线工具预测MAD1蛋白氨基酸组成及其理化特性,利用SMART在线程序分析其结构域。构建mad1重组真核表达载体并转化毕赤酵母,获得重组子,通过甲醇诱导表达得到MAD1蛋白;通过Ni-NTA亲和层析获得纯化蛋白。以纯化蛋白溶液（20 μg·mL^-1）浸没处理花生根0.5、6、12和24 h,通过qPCR检测花生根膜受体基因（CERK1、RPK）、免疫相关级联基因（MAPK、MMK1、CDPK）和转录因子基因（MYB86）、细胞壁整合基因（SCW1）及防御相关基因（PTi1、RML1A）的转录水平。【结果】克隆得到了绿僵菌黏附素基因mad1,全长2 136 bp,编码711个氨基酸,分子量约为74.8 kD;生物信息学分析表明,MAD1的N端有信号肽,C端有糖基磷脂酰肌醇（GPI）细胞壁锚定位点,且含有CFEM功能结构域,属于亲水性蛋白。成功构建了MAD1真核表达系统,诱导表达并纯化出具有生物活性的MAD1蛋白,对花生根进行不同时间段的处理,发现MAD1处理后0.5 h,根尖细胞感知并启动膜类识别受体基因CERK1表达;0.5—6 h,根膜受体基因CERK1、RPK转录水平均上调,膜整合基因SCW1转录由下调转为上调,免疫反应相关基因MAPK、MMK1、CDPK、MYB86的转录受到短暂抑制,防御基因PTi1、RML1A转录下调,植物根部免疫防御反应受到抑制;6—12 h,膜受体基因维持上调表达,而防御基因RML1A从下调逆转为强烈上调;12—24 h,膜受体类基因CERK1、RPK,防御基因PTi1、RML1A均上调,免疫相关级联基因MAPK、MMK1、CDPK,转录因子基因MYB86也出现微弱的上调,植物根部启动免疫防御反应。【结论】在绿僵菌与花生根的互作早期,绿僵菌MAD1蛋白 6 h时已激活花生根膜受体基因CERK1和RPK的识别响应,同时抑制花生免疫级联基因MAPK、CDPK、MMK1及防御相关基因如PTi1、RML1A的表达,有助于绿僵菌在花生根组织上定殖;随后诱导花生细胞壁整合基因SCW1上调表达,参与根上受损细胞壁的修复与重建,促进绿僵菌与花生共生关系的建立。诱导植物的免疫抑制和细胞壁重建整合可能是绿僵菌与植物建立共生关系的重要步骤。     

意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的免疫应答

【目的】通过对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）胁迫的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T）转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log₂ fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）验证转录组数据的可靠性。【结果】 差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为mRNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-qPCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。     

二化螟P糖蛋白基因的克隆分析及对杀虫剂的诱导响应

【目的】克隆二化螟（Chilo suppressalis）P糖蛋白基因（CsPgp）并对其分子特征和表达模式进行分析,明确CsPgp对常用防治杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的诱导响应并对其潜在的转录调控机制进行探索。【方法】使用基因克隆技术扩增CsPgp全长基因序列,利用生物信息学技术对CsPgp编码蛋白的分子特征和5′端转录调控区中的转录因子结合位点进行分析。使用荧光定量PCR方法对CsPgp在二化螟不同龄期和不同组织中的表达模式及在杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素不同剂量处理下的诱导响应进行测定分析。【结果】CsPgp cDNA序列全长4 584 bp,由23个外显子构成,编码1 259个氨基酸,含有两个跨膜区和两个核苷酸结合区,具有ABC转运蛋白家族典型的结构特征,如对底物转运具有重要功能的Walker A、Walker B及D、H、P、Q-Loop等特征序列。CsPgp主要在二化螟幼虫期表达,在3—4龄幼虫中具有最高的表达量,在蛹期和成虫期的表达量较低。组织表达分析表明,CsPgp主要高表达于二化螟的前肠和中肠组织,在后肠、脂肪体、马氏管等其他组织中的表达量较低。相比于对照,使用LC₃₀和LC₇₀剂量氯虫苯甲酰胺分别处理二化螟3龄幼虫12 h和24 h后,CsPgp的表达量未发生显著变化。但在处理36 h后,LC₃₀处理组试虫中CsPgp显著上调表达,而LC₇₀处理组试虫中CsPgp则显著下调表达。使用低剂量0.05 mg·L^-1的阿维菌素处理二化螟试虫12 h后,相比于对照,CsPgp显著下调表达,在处理24 h和36 h后CsPgp的表达水平没有发生显著变化,使用0.15 mg·L^-1的阿维菌素处理二化螟试虫24 h和36 h后CsPgp被显著诱导上调表达。对CsPgp的5′端转录调控区的序列分析发现,在转录调控区中预测到多个转录因子结合位点,其中包括5个潜在的CncC结合位点。【结论】二化螟CsPgp在重要解毒代谢组织中肠中高表达,并且能够被杀虫剂氯虫苯甲酰胺和阿维菌素诱导表达,表明CsPgp可能参与对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素的解毒代谢。CsPgp 5′端转录调控区中含有多个转录因子CncC结合位点,可能对CsPgp的转录表达具有重要调控作用。推测在氯虫苯甲酰胺或阿维菌素胁迫下,CsPgp可能受到转录因子CncC的转录调控并参与对氯虫苯甲酰胺或阿维菌素的解毒代谢。     

CO2加富条件下胡萝卜光合通路及差异基因表达分析

为了探究CO₂加富条件下胡萝卜光合通路及相关差异基因表达，试验在日光温室中分别设置富碳区(FC,CO₂浓度为(800±50)μmol/mol)和对照区(CK，自然环境)，于收获期测定产量，处理61 d后收集胡萝卜叶片进行转录组测序，并对富碳处理后的差异表达基因进行KEGG注释和代谢途径分析，最后对gene33346、gene33340和gene33386等3个光合相关基因进行实时荧光定量PCR验证。结果表明，CO₂加富条件下总生物学产量、地上部鲜质量和地下部鲜质量均显著高于对照区，且较对照区增产36.56%。转录组结果表明，各样品的Q30碱基百分比均不小于95.24%，说明测量结果较为准确，可用于下一步数据分析；差异表达基因KEGG富集结果表明，光合通路为显著富集的第一条通路，说明CO₂加富对光合产生了显著影响。光合相关基因在富碳条件下上调表达，推测可能是由于其参与了光合过程中的电子传递和ATP的合成；其中gene33346、gene33340和gene33386等3个光合相关基因的相对表达量与其F...     

1-MCP和SO2保鲜剂处理阳光玫瑰葡萄的转录组学分析

【目的】分析2种保鲜剂处理阳光玫瑰葡萄贮藏阶段基因差异表达情况，为从分子生物学角度研究保鲜剂处理对葡萄果实贮藏品质影响的调控机制提供理论参考。【方法】以阳光玫瑰葡萄为试材，采用1-甲基环丙烯（1-MCP）和二氧化硫（SO₂）保鲜剂分别对果实进行冰温贮藏（-1~1℃），并以不使用保鲜剂的果实为对照，对贮藏1、5、9、13和17周的2种保鲜剂处理及对照的果实分别取样开展转录组学分析，通过实时荧光定量PCR结果证实转录组测序结果的可靠性。【结果】从对照和2种保鲜剂处理的转录组测序结果中共获得371.64 Gb的原始数据，各样品Clean data均达6.03 Gb，GC含量为46.28%~47.53%，Q30≥93.50%，与葡萄参考基因组的匹配率为75.75%~90.23%。1-MCP处理与对照的差异表达基因数在贮藏后13周达最高值，而SO₂处理与对照及SO₂处理与1-MCP处理的差异表达基因数在贮藏后5周达最高值。贮藏1周和13周时，1-MCP处理与对照之间差异表达基因最多，分别为965和2881个；贮藏5周和9周时，SO₂处理与对照之间差异表达基因最多，分别为3698和1628个；贮藏17周时，处理和对照两两比较获得的差异表达基因相差不大。贮藏1~5周果实内部发生细胞组分、分子功能和生物过程等方面的变化较贮藏中后期更为剧烈，且在MYB、AP2/ERF-ERF、NAC、GARP-G2-like、HB-HD-ZIP和WRKY转录因子的调控下，单萜合成相关结构基因表达量在贮藏5周后迅速降低。基于实时荧光定量PCR的所有样本中苯丙烷—类黄酮、类胡萝卜素和单萜合成代谢路径相关基因表达水平检测结果与转录组测序分析结果基本一致。【结论】 1-MCP与SO₂保鲜剂对阳光玫瑰葡萄贮藏产生不同影响，前者在贮藏过程中抑制果实成熟和衰老作用释放较后者更为平缓，且通过阻断乙烯与受体结合并抑制ETR、EIN3和ERF1/2这3个乙烯信号通路关键基因表达发挥延缓衰老作用。转录因子MYB、AP2/ERFERF、NAC、GARP-G2-like、HB-HD-ZIP和WRKY与单萜合成基因相关性较强，且6类转录因子之间存在较强相关性，其可能通过互作调控果实单萜合成或其他成熟衰老过程。     

桑葚幼果的落果与正常果的果柄转录组分析

  目的  果实的脱落是一种常见的生理现象，会在一定程度上限制果实的产量。探究桑葚幼果在脱落过程中的代谢及生化反应，可为桑葚的脱落机制研究提供参考。  方法  通过高通量测序对白桑Morus alba幼果在落果和正常果的果柄离区进行转录组测序，筛选差异表达基因，并对其进行功能注释和代谢通路分析，采用实时荧光定量PCR技术对转录组数据进行验证。  结果  经华大基因转录组测序分析共计获得262.92 Mb的原始序列；桑葚幼果果柄在2种状态下共筛选到10 481个差异表达基因，其中，有5 239个差异表达基因上调表达，5 242个差异表达基因下调表达。经基因本体数据库(GO)功能富集分析，共发现37个显著性条目，大多数差异基因具有催化活性、膜的组成成分、氧化还原酶活性、膜的内在成分等功能；京都基因与基金组百科全书(KEGG)富集分析发现:大多数差异表达基因集中在柠檬酸循环、植物激素信号转导途径、黄酮类生物合成等代谢通路上。  结论  桑葚在脱落过程中受植物激素的调控，氨基酸、黄酮类次生代谢物和碳水化合物等物质也能调控果实脱落。图9表2参35     

高茶氨酸茶树新品系‘福黄1号’黄化变异机理

【目的】分析茶树黄化变异相关的代谢和转录机制,探究高茶氨酸茶树新品系‘福黄1号’的黄化变异和高茶氨酸形成机理。【方法】以茶树‘福安大白茶’及其黄化突变种质‘福黄1号’为试验材料,利用超微电镜、广泛靶向代谢组学、靶向代谢组学及转录组学联合分析,确定茶树黄化变异相关的色素、代谢物及转录组数据。【结果】超微结构显示,‘福黄1号’的叶绿体类囊体呈现丝状,基粒片层排列散乱不规则,片层间疏松,存在许多异常的囊泡。色素含量测定表明,叶绿素a和叶绿素b含量显著下降,叶绿素a/b比率下降,相关基因SGR表达显著下调,黄化叶片中光捕获叶绿素a/b蛋白（LHC）表达显著下调。类胡萝卜素总含量虽然差异不大,但各组分含量显著变化,玉米黄质为唯一显著增加的组分,其调控基因VDE表达显著上调,其余组分含量均下降。与‘福安大白茶’相比,‘福黄1号’中共鉴定到680个差异表达基因（DEGs）和57个显著变化的代谢物（SCMs）。KEGG富集分析表明,SCMs和DEGs显著富集到氨基酸生物合成、谷胱甘肽代谢以及TCA循环等途径。此外,与碳和氮代谢相关的通路也被激活。通过靶向测定,共鉴定到19种游离氨基酸,新品系‘福黄1号’游离氨基酸含量显著高于‘福安大白茶’,达到97.13 mg∙g^-1,其中茶氨酸为66.90 mg∙g^-1,占氨基酸含量的68.89%,而精氨酸含量达到8.46 mg∙g^-1,是‘福安大白茶’的56.4倍。调控氨基酸合成的GOGAT和GLU的表达量上调1.17倍和3.17倍。【结论】‘福黄1号’的芽叶色泽主要受叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮等色素代谢的影响,SGR和4种LHCs的共同作用也可能影响叶绿体的生物合成来调节叶片色泽。‘福黄1号’茶氨酸含量显著高于‘福安大白茶’的原因主要是泛素化相关的蛋白质水解酶表达上调蛋白降解能力加强,叶绿素和其他含氮分子生物合成的减少,以及黄化叶中碳骨架的缺乏,氨基和氮资源被更有效地储存,使得与氨基酸合成相关的氮代谢激活,茶氨酸合成前体物质之一的谷氨酸积累,这可能促使茶氨酸成为黄化叶中显著积累的含氮化合物。     

葡萄VlCKX4表达特性分析与转录调控预测

【目的】通过克隆细胞分裂素脱氢酶/氧化酶基因VlCKX4及其启动子，进行表达特性分析和启动子活性分析并进行转录因子预测，为深入解析VlCKX4介导细胞分裂素信号途径调控葡萄坐果的分子机制提供依据。【方法】使用生物信息学方法分析‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera×Vitis labrusca)细胞分裂素氧化酶/脱氢酶4(VlCKX4)的序列特征；利用PCR技术克隆该基因以及它的启动子，使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)分析VlCKX4的表达特性，GUS活性试验用于分析其启动子活性；利用PlantTFDB、CisBP等转录调控数据库对VlCKX4的转录调控关系进行预测分析，输出结果使用Gephi软件进行可视化。【结果】VlCKX4全长1 582 bp,其中包含1 566 bp的开放阅读框，编码522个氨基酸，具有家族特征的FAD结构域和细胞分裂素结合（ck-binding）结构域。qRT-PCR结果表明VlCKX4在花序中高表达，其次是叶片，在卷须中表达量最低；细胞分裂素CPPU处理后VlCKX4表达量先下降后上升，细胞分...     

vvi-miR172s及其靶基因响应赤霉素调控葡萄果实发育的作用分析

【目的】miR172是植物生长发育的重要调节因子,阐释vvi-miR172s及其靶基因应答赤霉素在葡萄果实不同组织发育过程中的作用,从miRNA角度认识GA调控葡萄果实发育的作用机制。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄为材料,以miR-RACE和PCR技术克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,由psRNA Target软件预测vvi-miR172s的靶基因;利用RLM-RACE技术验证vvi-miR172s剪切靶基因的裂解作用及其作用位点;采用生物信息学软件对靶基因、靶蛋白进行系统进化、序列结构分析及亚细胞定位预测;通过在线软件PLANTCARE进行启动子作用元件分析;通过qRT-PCR和芯片数据分析vvi-miR172s和靶基因在不同器官、不同发育阶段的基因表达图谱,以及应答GA₃在果实不同组织中的时空表达模式。【结果】克隆鉴定了vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,预测到VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2和VvRAP2-3四个靶基因,验证到裂解产物及其裂解位点,证明它们为vvi-miR172s的真实靶基因。序列结构分析显示,VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均含有10个外显子和9个内含子,其motif元件的种类和数量相似,均含有两个排列顺序相近的AP2蛋白结构域,表明其结构和功能具有一定的保守性;且VvAP2、VvRAP2-1和VvRAP2-2与杨树的亲缘关系较近,VvRAP2-3与大豆具有较高的同源性;靶基因蛋白二级结构均为α-螺旋,可进一步折叠为稳定的三级结构;4个靶蛋白亚细胞定位主要位于细胞核内。启动子作用元件分析发现vvi-miR172c和VvRAP2-1中含有赤霉素响应元件,表明它们可能响应赤霉素调控葡萄生长发育;芯片数据分析显示vvi-miR172c和靶基因的表达模式具有组织或器官特异性,且它们之间呈现一定的负相关,表明它们之间存在负调控作用;RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,果皮中vvi-miR172a/b/d呈下降的表达趋势,而靶基因VvRAP2-1的表达模式相反,表明vvi-miR172a/b/d对VvRAP2-1负调控;果肉中vvi-miR172d的表达水平降低,而靶基因VvAP2的表达水平增加,表明vvi-miR172d与VvAP2呈负相关性。另外,GA₃处理改变了vvi-miR172s的靶模式,增强了果肉和果皮组织中vvi-miR172d与VvRAP2-1的负相关性,同时诱导了vvi-miR172c对VvAP2/VvRAP2-2/VvVvRAP2-3的负调控作用。【结论】VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均为葡萄miR172a/b/c/d的真实靶基因,vvi-miR172家族可能通过vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172d分别介导靶基因VvRAP2-1和VvAP2调控果皮和果肉组织的发育过程,而vvi-miR172c和vvi-miR172d及其靶基因可能是GA调控葡萄果皮与果肉组织发育的主要作用因子。     

GA3介导miR171s及其靶基因VvSCLs调控葡萄种子发育的作用分析

【目的】鉴定vvi-miR171s成员及其靶基因,明确vvi-miR171s成员及其靶基因在葡萄种子发育中的重要作用及其响应赤霉素（Gibberellin,GA）调控种子发育的表达模式。【方法】以‘魏可’葡萄（‘Wink’）果实为试材,利用miR-RACE技术鉴定vvi-miR171a/b/e/f/g/h的成熟体序列;通过PsRNATarget软件预测vvi-miR171s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行染色体定位、系统进化树、基因结构、保守结构域及motif分析;通过启动子作用元件分析预测vvi-miR171s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证vvi-miR171s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA₃在葡萄种子区中的表达模式。【结果】从‘魏可’葡萄果实中鉴定并克隆了6条葡萄vvi-miR171s成熟体序列,并用RLM-RACE和PPM-RACE鉴定到3条靶基因VvSCL6/15/22。靶基因的生物信息学分析显示,VvSCL6/22与苹果、桃子和樱桃同源基因遗传距离较近,而VvSCL15则与拟南芥、苹果、桃子和樱桃中的同源基因遗传距离相同,且VvSCLs的基因结构也与进化树中亲缘关系较近的基因相似;SCLs蛋白均具有GRAS结构域,鉴定到5个与GRAS结构域对应的保守motif,且它们含有的motif元件类型及排列顺序均相似,表明SCL家族结构较为保守。vvi-miR171s及靶基因的启动子均具有大量的GA、水杨酸（Salicylic acid,SA）和种子发育相关作用元件,表明它们可能参与响应GA、SA和种子发育过程;qRT-PCR表达分析显示,GA₃强烈抑制了种子区vvi-miR171a的表达,但同时显著上调种子区的VvSCL15和VvSCL22表达;vvi-miR171a和VvSCL15在对照组和GA₃处理后的种子/种子区均呈强烈的负相关,表明GA₃可能在葡萄种子/种子区显著增强vvi-miR171a对VvSCL15的负调控作用,从而介导葡萄种子发育。【结论】在‘魏可’葡萄中鉴定到vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6个成员;均可裂解VvSCl6/15/22 3个靶基因;vvi-miR171a-VvSCL15可能作为主要的调控途径响应赤霉素并参与调控葡萄种子发育。     

夜间延时补光调控对巨峰葡萄春果生长发育及光合特性的影响

【目的】探讨3种光质补光对巨峰葡萄春果生长发育及光合特性的影响,为完善广西巨峰葡萄春果栽培管理技术提供理论依据。【方法】以5年生设施栽培巨峰葡萄为试验材料,在新梢展叶期至果实成熟期,应用白、红、蓝3种光质进行夜间非连续光照6 h（03:00—06:00和18:00—21:00）处理,以自然光照为对照（CK）,研究不同补光处理对巨峰葡萄春果新梢生长、叶片叶绿素含量、光合生理及果实生理生化等指标的影响。【结果】在3种不同光质补光条件下,巨峰葡萄春果新梢基部粗度、1~10节总长度、叶长、叶宽、叶柄长和叶厚均高于CK;其中蓝光6 h处理的新梢基部粗度和1~10节总长度增量最大,分别较CK显著增加12.80%和27.00%（P<0.05,下同）;白光6 h处理的叶长、叶柄长、叶厚和叶片长宽比等指标表现最优,分别较CK提高11.78%、55.90%、12.90%和1.85%;红光6 h处理的叶宽表现最大,较CK显著提高15.06%;相较于CK,在巨峰葡萄春果各生长期夜间补充白光6 h和红光6 h均能提高其叶片叶绿素含量;不同光质补光处理的巨峰葡萄春果叶片净光合速率、气孔导度和蒸腾速率及果实单粒重、横径和可溶性固形物含量均呈现不同程度升高,而叶片胞间CO₂浓度和果实可滴定酸含量呈现不同程度降低。【结论】在巨峰葡萄春果栽培过程中,夜间补充白光6 h和红光6 h能在一定程度上弥补光照的不足。因此,可通过人工补光调节葡萄的生长发育状况,提高果实品质。     

有机替代对土壤特性及酿酒葡萄根活力和浆果品质的影响

【目的】 宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄施肥管理过程中长期施用化肥,不施或少施有机肥导致土壤板结,存在土地质量下降,肥料利用率不高,酿酒葡萄品质下降等问题,研究有机替代对土壤特性及酿酒葡萄根活力和浆果品质的影响。【方法】 以6年生酿酒葡萄品种赤霞珠为研究对象,分别设置CK(不施肥)、T₁(100%化肥)、T₂(100%有机肥)、T₃(50%有机肥+50%化肥)、T₄(25%有机肥+25%化肥+土壤调理剂)5个处理。【结果】 50%的有机替代较不施肥和100%施化肥处理,在20~40 cm土层土壤微生物量碳和微生物量氮含量分别升高26.17%、14.61%和44.65%、22.81%,在40~60 cm土层,土壤呼吸强度和微生物量磷含量分别升高59.23%、25.71%和66.23%、19.07%,可溶性固形物和固酸比分别降低7.12%、4.75%和21.99%、14.92%,可滴定酸和单宁含量分别升高19.05%、11.94%和25.36%、12.24%,、总酚和花色苷含量分别升高17.70%、9.94%和35.22%、18.92%。【结论】 施用50%的有机肥替代化肥改善土壤特性和提升酿酒葡萄浆果品质效果最佳。     

灌水量对限根栽培‘阳光玫瑰’葡萄果实发育与香气物质积累的影响

【目的】通过分析不同灌水量处理对葡萄果实品质指标、香气组分积累、香气物质合成相关基因表达影响的差异，确定灌水模式与鲜食葡萄感官品质形成间的关系，为限根栽培葡萄最佳灌水量的确定提供参考。【方法】以鲜食葡萄‘阳光玫瑰’为试材，设置对照组CK、轻度水分亏缺组（DI-1）、重度水分亏缺组（DI-2），系统比较不同灌水量对葡萄果实外观形态指标、色泽指标、香气组分、萜烯合成相关基因表达水平等的影响。【结果】灌水量影响葡萄果粒的形态与质地特征，采收期时葡萄果粒的纵径并未受到灌水量的显著影响，而亏缺灌溉组果粒的横径、单粒重显著降低（P<0.05）。葡萄果肉的硬度也受到亏缺灌溉的影响而下降，特别是DI-2组，葡萄果肉硬度明显低于其他处理组。亏缺灌溉组DI-1、DI-2的葡萄果实中葡萄糖含量显著高于对照处理，重度亏缺组DI-2果糖含量显著高于其他处理，而轻度的亏缺灌溉（DI-1）并未对葡萄果实的可溶性固形物、可滴定酸含量产生显著影响。亏缺灌溉处理下葡萄果皮中叶绿素、类胡萝卜素含量均出现降低，DI-2组果皮中叶绿素与类胡萝卜素含量的比值最低。灌水量影响到葡萄果实中香气组分的积累，对于萜烯类物质，轻度亏...     

葡萄miR159s靶基因的鉴定及其应答GA在果实不同组织的调控作用

【目的】鉴定葡萄miR159家族成员及其靶基因,明确葡萄miR159家族成员及其靶基因应答外源赤霉素（GA）在无核葡萄果实不同组织发育过程中的作用。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄（Rosario Bianco）为试材,利用miR-RACE和PCR技术克隆鉴定VvmiR159a/b/c的成熟体及前体序列;通过PsRNATarget软件预测VvmiR159s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行系统进化及保守结构域分析;通过启动子作用元件分析预测VvmiR159s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证VvmiR159s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA在葡萄果实不同组织发育过程中的时空表达模式。【结果】从‘白罗莎里奥’葡萄果实中克隆获得VvmiR159a/b/c的成熟体序列、前体序列并折叠发夹结构。鉴定到VvmiR159s的四条靶基因（VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15、VvGRAS-l）,其中VvmiR159s与VvGAMYB匹配程度最高,与VvAIX15匹配程度最低。靶基因系统进化及保守结构域分析显示,4条靶基因与其他物种同源基因具有较高同源性。VvmiR159s前体基因及其靶基因启动子的激素响应元件均以赤霉素和水杨酸响应元件为主,表明其可能主要通过应答这两种激素参与调控葡萄的生长发育过程。VvmiR159s在不同组织中的表达具有时空特异性,其中VvmiR159c在果皮和果肉中的表达趋势不同,在果皮中VvmiR159a/b/c与VvAIX15的表达水平呈负相关;而在果肉中,VvmiR159a/b与VvGAMYB和VvAIX15的表达模式相反。此外,在葡萄果皮、果肉中GA处理可显著下调VvmiR159a/c的表达,但却在幼果果肉中上调VvmiR159b的表达。表明葡萄miR159家族成员在果实不同组织中通过不同模式应答GA信号参与果实发育的调控。【结论】葡萄miR159家族含有VvmiR159a/b/c 3个成员;3个成员均可切割VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15及VvGRAS-l 4个靶基因;VvmiR159a/b/c及其4个靶基因可能以不同的GA应答模式参与调控葡萄果皮与果肉的发育。     

模式改造对灰枣树个体和群体冠层特性及机械适应性的影响

【目的】研究枣树不同栽培模式的冠层特征,分析不同模式之间枣树个体和群体冠层特性差异及其相关性,寻找适合枣树集约化、机械化和标准化生产的栽培模式。【方法】以3～4 a灰枣树为试材,将株行距为1.0×1.5(m),树形为疏散分层形的原栽培模式(CK),将其一部分改造为株行距1.0×4.5(m)的篱壁形、主干形和“Y”形,冠高控制在2.5 m左右的3种新型模式,即M₁、M₂、M₃。将改造完成后的新模式作为试验组,原种植模式作为对照(CK)。对各模式枣树5～7月的株高、冠幅、作业间距以及个体和群体冠层特性进行了分析研究。【结果】M₂株高最高,M₁株高最低,6、7月时M₁与M₃和CK差异不显著,各模式的株高均在2.5 m左右且生长良好;5～7月,M₁冠幅显著最小,M₁为89.1 cm,较CK小13.1%;M₂冠幅与CK无显著差异,M₂为99.0 cm; M<...