猕猴桃溃疡病菌噬菌体的初步研究

以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为指示菌,从猕猴桃溃疡病病枝中分离到一株噬菌体,对该噬菌体进行了热稳定性、pH值稳定性、紫外线稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的测定。结果表明:噬菌体的热稳定性较弱,在65℃下10 min内即可全部失活;在pH值4~9的范围内噬菌体均可稳定存在;紫外线下照射12 min,噬菌体几乎全部失活;噬菌体的最佳感染复数为0.1;感染指示菌的潜伏期约60 min,爆发期约70 min,烈解量为123。这是首次关于猕猴桃溃疡病菌噬菌体的报道。     

猕猴桃溃疡病病原菌及检测方法研究进展

猕猴桃细菌性溃疡病的发生具有潜伏性、传播速度快、防治困难等特点,目前已经成为一种危害世界猕猴桃生产的毁灭性病害,其病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae,Psa）。综合国内外相关研究报道,就猕猴桃溃疡病病原菌特点、防治、传播及检测等方面进行了系统综述,旨在加深对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的认识,同时为开展该病原菌的早期检测及防治研究奠定基础。     

奉新县猕猴桃溃疡病病原菌鉴定

为明确江西省奉新县猕猴桃溃疡病病原菌种类。从该县7个猕猴桃生产基地采集呈典型症状的发病枝条和叶片,采用稀释分离法对其进行病菌分离并作致病性测定,共获得27个致病性细菌菌株。对各菌株进行培养性状、形态特征观察和生理生化测定,结果与文献中对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的描述相吻合。提取各菌株基因组DNA,分别对其16S rDNA和16S-23S rDNA基因片段进行PCR扩增、测序、序列分析和构建系统发育树,结果各菌株16S rDNA和16S-23S rDNA序列长度均为1 500 bp和280 bp,且菌株间序列完全一致。将获得的两段序列利用Blast程序分别在GenBank中进行同源性搜索,发现其与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种同源性均为100%。待鉴定菌株在系统发育树上与该变种处于同一分支。根据实验结果,将奉新县猕猴桃溃疡病的病原鉴定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。     

猕猴桃溃疡病菌质粒的分离与功能分析

分离猕猴桃溃疡病菌中的质粒,从质粒角度探索细菌的致病机制,分析其编码的主要基因、毒力因子。用试剂盒提取分离自安徽省岳西县猕猴桃溃疡病菌株JF8的质粒,对质粒DNA进行高通量测序及生物信息学分析。质粒基因组拼接显示菌株JF8质粒全长65 149bp,GC含量56.29%,包含45个假定蛋白(hypothetical protein)和38个有预测功能的蛋白。生物信息学分析发现,质粒携带多达8个直接参与基因重组和转移的转运蛋白(mobile element protein),5个基因直接参与细菌Ⅳ型分泌系统、1个基因参与细菌Ⅲ型分泌系统。基因ParA编码的蛋白是一个ATP酶,对质粒的分配以及维持质粒稳定具有重要作用,编码转录激活蛋白的基因LuxR与细菌的群体感应机制相关,影响毒力因子的表达和分泌,基因UmuC是细菌中SOS应答系统的组分之一,控制细胞中聚合酶Ⅴ的量。     

猕猴桃溃疡病发生特点和综合防治技术

我县从20世纪90年代初开始人工栽培猕猴桃，目前栽培面积已发展到667hmz，成为苏北地区最大的猕猴桃生产基地。自2001年发现猕猴桃溃疡病以来，此病已成为本县猕猴桃生产中的常发病害。据本县测报站调查，2001年全县平均病园率25％，平均病株率6．65％，病指2．76；2002年平均病园率43％，平均病株率19．2％，病指8．3；2003年平均病园率38．6％，平均病株率11．3％，病指3．52。     

猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定

为明确猕猴桃细菌性溃疡病致病菌种类与特征,以从安徽岳西、陕西户县和重庆黔江等猕猴桃主产区收集到的溃疡病感染枝条和树皮为材料,采用平板划线、梯度稀释和BPA培养法分离病原物,采用烟草过敏性反应和猕猴桃健康叶片接种观察其致病性,结合特异引物扩增的16S-23SrDNA-ITS序列分析,对病原菌种类进行分子鉴定。结果表明:从收集的溃疡病感染枝条和树皮中,共分离纯化得到10株分离物;所有分离物均可使烟草叶片产生过敏反应,猕猴桃叶片接种显示同一菌株对不同品种及不同菌株对同一品种的致病力均存在差异。对特异扩增得到的280bp 16S-23SrDNA-ITS序列进行Blast比对分析,结果表明:10个菌株为同一致病菌,其DNA片段大小和序列均与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae)完全一致。据此可以确定,试验分离所得的菌株均为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种。     

台州猕猴桃溃疡病病原菌分子鉴定及药剂筛选

为了针对性地防治猕猴桃细菌性溃疡病,采用平板涂布分离法从台州主要猕猴桃种植果园分离到1株丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv. actinidae,Psa)。用生物型(biovar)特异性引物检测发现,试验分离到的Psa菌株是biovar 3型。通过抑菌圈大小比较,对23种农用杀菌剂进行了筛选。结果表明,不同农用杀菌剂对Psa菌株的抑菌效果相差很大,且以四环素、乙蒜素和丁子香酚的抑菌效果较好(抑菌圈直径≥15 mm)。此外,用最小抑菌浓度(MIC)和时间-杀菌试验研究了纳米氧化锌对Psa菌株的杀菌效果。结果显示,纳米氧化锌的MIC值为50 μg·mL^-1,且杀菌效果随纳米氧化锌的浓度和作用时间的增加而增强。     

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

 利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中6个致病变种全细胞蛋白电泳,发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致,不同致病变种之间存在差异.以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异,结合营养筛选和血清学方法来进行.对丁香假单胞菌的6个致病变种的全细胞蛋白分析表明:全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种.     

淡紫灰链霉菌gCLA4对猕猴桃溃疡病预防效果及抑菌活性成分分离鉴定

为明确分离自黄瓜叶片的内生淡紫灰链霉菌gCLA4菌株（gCLA4）对猕猴桃溃疡病预防效果及其抗菌活性物质,通过室内离体枝条接种及田间喷淋树干的方法评价其预防效果;借助“生物活性追踪”方法,采用离子交换树脂吸附、凝胶柱层析、质谱、核磁共振波谱分析手段对gCLA4的抑菌活性物质进行分离鉴定。室内离体枝条和田间树干喷施结果表明,gCLA4菌株发酵液对猕猴桃溃疡病的防效分别为83.43%和71.07%,明显优于市场对照生防菌剂解淀粉芽孢杆菌Ba168 WP和枯草芽孢杆菌WP。室内分析鉴定显示其主要抑菌成分为链丝菌素F。皿内抑菌结果表明,链丝菌素F与商品中生菌素原药对病菌的抑制效果差异不显著,抑菌圈直径分别为20 mm和22 mm,大于gCLA4发酵滤液的抑菌圈直径16 mm。综上可见：gCLA4对猕猴桃溃疡病防控效果显著,其活性成分链丝菌素F,具有溃疡病绿色防控生物药剂开发应用的巨大价值和潜力。     

GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌的生物学特性 及其在土壤、根系中的定殖

【目的】获得具有荧光标记的猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）菌株,为进一步揭示其侵染致病过程奠定基础。【方法】电击法对病菌进行GFPuv基因标记,应用荧光显微镜和平板稀释法研究标记菌株在土壤和根部的定殖情况。【结果】GFPuv标记的猕猴桃溃疡病菌菌株在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,8株标记菌基因组DNA中均扩增出约700 bp的目的片段。标记菌株PSAmx7-GFPuv1的菌体形态、生长曲线、最适温度、最适pH、致病性均与野生型无显著差异,其绿色荧光可稳定遗传。标记菌在灭菌土壤中可存活3个月左右,在未灭菌土壤中也能存活3周;灌根1 d检测,根表、根内组织中可分离到目标菌落,随后标记菌株数量呈现“先增后降”的趋势。【结论】电击法成功地将GFPuv基因转入猕猴桃溃疡病菌;导入的GFPuv 基因对宿主菌的生物学特性没有影响;标记菌可在灭菌土壤中长期存活,并在根部定殖和增殖。     

云南省烟草野火病菌毒素的致病性评价*

 主要通过对烟草野火病菌菌株（Pseudomonas syringae pv. tabaci）致病力与其粗毒素毒力的相关性的研究，评价了烟草野火病菌毒素在致病过程中的作用。结果表明：①野火菌毒素毒力与其菌株的致病力呈极显著相关性，相关系数r达0.928；②高感和中感品种K326,云85对病原菌的感病性与对菌毒素的敏感性在P<0.05的水平上有相关关系；③从病斑处可以分离到该毒素，再接种能重现野火病症状；④抑菌物质对病原菌和病菌毒素的抑制作用相一致。     

陕西关中地区猕猴桃溃疡病菌对CuSO4的抗性评价

为明确陕西省猕猴桃细菌性溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）对CuSO₄的抗性水平及与copA和copB基因表达量的相关性,使用最小抑菌浓度法（MIC）对分离自陕西省关中地区的84株Psa菌株对于CuSO₄的抗性进行检测。在此基础上,使用实时荧光定量PCR方法,对3株不同抗性水平Psa菌株的基因copA和copB与抗铜性的关系进行了分析。结果表明,供试的84株Psa菌株MIC分布在3.75~6.25 mmol·L^-1范围内;不同地区来源的菌株对CuSO₄的抗性表现出明显的差异,其中分离自周至的Psa菌株的抗铜水平明显高于眉县。实时荧光定量PCR分析结果显示,不同浓度CuSO₄条件诱导下,3株不同抗性水平的菌株抗铜基因copA和copB表达水平与CuSO₄浓度成正相关,且菌株的抗性水平越高,基因copA和copB相对表达水平亦越高。陕西省关中地区的Psa菌株对CuSO₄表现出较高的抗性水平,且不同地区的Psa菌株的抗性表现出明显差异;copA和copB基因参与了Psa菌株对铜离子的适应性反应。     

猕猴桃细菌性溃疡病研究进展

笔者总结了近年来国内外学者对猕猴桃细菌性溃疡病的研究和发现,详细介绍了猕猴桃细菌性溃疡病的症状、危害和传播途径以及致病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae的特征、分类和起源,分析了其可能的致病机理并总结了猕猴桃的抗病性研究。基于目前对猕猴桃细菌性溃疡病的防治方法和相关研究发现,展望了猕猴桃细菌性溃疡病的研究方向和防治措施,提出采取预防致病菌传入、增强树势和药剂防治相结合的防治措施,为以后的研究和生产实践提供了理论依据。     

引起梨花枯和芽枯的Pseudomonas syringae pv.syringae 病原细菌鉴定

 【目的】明确在中国发生的梨花枯和芽枯的确切病原菌。【方法】用普通细菌学方法、电镜观察、Koch氏病原假说测定、Biolog、脂肪酸分析、PCR及与标准对照菌株的比较。【结果】从16个病样中分离获得12菌株,6株代表菌株显示出与Pseudomonas syringae pv. syringae 3株标准对照菌株相似的致病反应,它们的Biolog和脂肪酸分析的相似度分别为0.57～0.86 和0.58～0.81,PCR和序列测定结合上述结果证实了P. syringae pv. syringae为该病的病原菌。【结论】首次证实了中国梨树上的花枯和芽枯可由P. syringae pv. syringae引起。     

Pear Blossom Blast Caused by Pseudomonas syringae pv.syringae in China

This study was done to determine the causal organism of the pear blossom and bud blast in China. It was identified by a bacteriological test, electro-microscopic observation, Koch＇s postulate test, Biolog, fatty acid methyl esters （FAMEs）, and a polymerase chain reaction （PCR） test, and compared with the standard reference strains. Six representative strains out of 20 pathogenic bacterial isolates from 16 diseased samples showed characteristics similar to three standard strains of Pseudomonas syringae pv. syringae from Belgium. They were identified as P. syringae pv. syringae with a Biolog similarity of 0.57-0.86 and FAMEs similarity of 0.58-0.81. The bacterium was reisolated from the symptomatic plants and blossoms. Identification as P. syringae pv. syringae was confirmed by using PCR primers and sequence tests, and compared with the above-mentioned results. The data supported the fact that the pear blossom and bud blast in China could be caused by P. syringae pv. syringae.     

三七细菌性叶斑病病原菌鉴定

[目的]对引起三七细菌性叶宽病的病原菌进行系统鉴定。[方法]以2011及2012年在云南文山及石林县的三七苗圃采集的三七细菌性叶斑病病株为材料,采用柯赫氏法则,检测分离菌株致病性并重新分离得到病原菌。通过病菌形态观察、致病性测定、16SrD—NA序列分析及生理生化特性分析（Biolog系统）对其进行鉴定。[结果]确定三七细菌性叶斑病病原菌为丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv．syringae）。[结论]该研究为三七细菌性叶瘫病菌详细鉴定的国内首报。     

浙江省猕猴桃溃疡病发病现状调查及影响因子分析

通过对浙江省5个猕猴桃主产区（江山、泰顺、宁海、上虞和桐乡）10个乡村30个猕猴桃园的猕猴桃溃疡病发病特点的调查分析,初步探明猕猴桃溃疡病发病程度与栽培品种密切相关,在红阳、布鲁诺、徐香、华特和金丰5个调查品种中,红阳最易感病,其定植后第二年的发病率有的猕猴桃园达100%。随着树龄的增大、树势的衰弱,溃疡病危害逐渐加重;相同树龄果园,负载量大的则树势较差,其发病率亦高。至一定海拔高度后,猕猴桃溃疡病的发病率和病情指数随着海拔高度的上升而增长,而对于同海拔果园,其发病率和病情指数在向阳坡与背阳坡之间均存在极显著差异。发生猕猴桃溃疡病的严重程度因产区不同而有一定差异,除了气象因子不尽相同之外,管理水平、排灌能力和立地条件等均为影响溃疡病发生的重要因素。