变形杆菌环介导等温扩增检测法的可视化方法的比较

通过比较现有几种可视化检测环介导等温扩增反应产物的方法,建立一种可视化检测变形杆菌的方法。利用已有的LAMP检测变形杆菌的方法作为出发检测体系,比较了焦磷酸镁反应沉淀观察法和分别单独添加核酸染料SYBR Green I、孔雀绿(Malachite Green)、钙黄绿素-氯化锰(Calcein-MnCl2)的可视化检测方法,结果显示,焦磷酸镁沉淀的指示效果较差,SYBR Green I法会造成实验场所的交叉污染,孔雀绿法指示反应不够灵敏,钙黄绿素-氯化锰法综合考虑较优;并证明该方法用于可视化LAMP检测变形杆菌,具有良好的特异性,灵敏度达到4.8CFU/mL。试验证明钙黄绿素-氯化锰法是一种较优的LAMP可视化检测法。     

应用环介导逆转录等温扩增技术快速检测新城疫病毒

参考新城疫病毒融合基因(fusion gene, F gene)序列,设计了2对能够特异性地识别F基因上的6个区域的引物,并以此建立了一种简单、快速、有效的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法检测NDV. 试验结果表明:该方法用时短(2 h内完成)、特异性好而且灵敏度高,最小检测限可达100 pg;对人工发病样品进行鸡胚分离和RT-LAMP检测,二者的阳性符合率高达93.5%;同时采用镁离子沉淀对检测结果进行可视化处理,方便利用肉眼直接观察.     

联合环介导等温扩增和横向流动试纸条可视化检测副猪嗜血杆菌

为快速鉴定临床上的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术结合横向流动试纸条(LFD)测定法进行核酸扩增和结果的可视化判定。选择副猪嗜血杆菌inf B基因中保守序列设计5组环介导等温扩增引物,筛选最适引物组;用生物素和6-FAM标记内引物用于LAMP扩增反应,结合LFD建立了副猪嗜血杆菌LAMP-LFD快速检测方法,并测试该方法的特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果。结果表明：1)优化后的LAMP在66℃下运行30 min, LFD可以在5 min内特异性、直观地检测到副猪嗜血杆菌;2)特异性强,与其他5种细菌无交叉反应;3)敏感度高,其最低检测浓度为1.285×10^-12 ng/μL,较普通PCR方法灵敏度显著提高;4)采用该方法对52份临床样品进行检测,副猪嗜血杆菌阳性率为19.2%(10/52),与LAMP检测结果的符合率为100%。综上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、灵敏、准确地应用于副猪嗜血杆菌的可视化检测,而且操作简单、仪器设备要求及检测成本低、耗时短,适用于基层养殖场副猪...     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是利用2对特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效地扩增DNA的新技术,扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳图谱呈阶梯式带状分布,反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生,可通过肉眼定性判断反应结果.LAMP技术已在核酸的科学研究、疾病诊断和动物胚胎性别的鉴定等领域得到了广泛的应用.从LAMP技术的原理、引物组成及反应过程、技术特点、方法延伸和应用等方面对其进行了概述,以期为同类研究提供参考.     

环介导等温扩增技术检测沙门氏菌反应体系的优化

[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

环介导等温扩增技术快速检测血液中白色念珠菌

目的 探讨环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测血液中白色念珠菌的可行性.方法 采用通用基因组DNA提取试剂盒提取血液中白色念珠菌DNA,应用LAMP方法进行扩增,采用浊度仪进行检测.结果 该方法能够检测出血液中白色念珠菌,而其它临床常见血流感染的...     

广西柑橘黄龙病发生情况及黄龙病菌的遗传多样性分析

【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病（Huanglongbing,HLB）危害情况及黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas）的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2个年度（2020和2021年）的跟踪调查并随机采集1048份柑橘叶片样品,利用qPCR技术对采集的样品进行CLas检测,并对阳性样品CLas菌株的基因组高变区的扩增产物进行测序,分析CLas菌株的遗传多样性。【结果】与2020年相比,除采自百色的柑橘样品CLas检出率2个年度保持不变（14.29%）外,2021年采自玉林、桂林、河池、梧州、南宁、贺州和来宾的柑橘样品CLas检出率均呈上升趋势,其中2021年采自梧州的柑橘样品CLas检出率最高（52.94%）。不同种类柑橘的CLas检出率差异明显,2021年甜橙类、柚类、杂交柑类和金柑类的样品CLas检出率均较2020年升高,2个年度的宽皮柑橘类CLas检出率相同（14.29%）。不同症状类型的柑橘样品CLas检出率也存在较大差异,其中2021年采集的缺素黄化型样...     

环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。     

携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

[背景]在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展.前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙...