肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因，并定向克隆到pET32a(+)中，转化宿主菌BL21（DE3）。重组菌经1mM IPTG诱导，在30℃下，5h时表达产物（分子量约为37KD）达到高峰，表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中，经Western blot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种试验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠，对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白的表达及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因,并定向克隆到pET-32α( )中,转化宿主菌(E.coli)BL21(DE3)。重组菌经1mmolLIPTG诱导,在30℃下,5h时表达产物(分子量约为37kD)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中,经Westernblot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种实验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠,对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

绿色荧光蛋白与黄瓜花叶病毒运动蛋白融合基因的构建及在大肠杆菌中的表达

采用重组－PCR方法，扩增获得绿色荧光蛋白（GFP）与黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMV MP）融合基因，将其克隆到pKEN上，构建了该融合基因的原核表达载体pKENG-M。SDS－PAGE及免疫印迹分析显示，57kD的融合蛋白基因在大肠杆菌DH5α中正确表达，激光共聚焦显微镜分析表明，在488nm光激发下，菌体呈亮绿色，表明融合蛋白保持绿色荧光特性。实验结果为进一步研究CMV MP的功能及其与胞间连丝和其他细胞成分的作用关系奠定了基础。     

猪源抗菌肽Protegrin-1基因在大肠杆菌中的融合表达

为了使猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)在原核表达载体中获得高效表达,在不改变PG-1氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏好密码子表,替换PG-1部分密码子,设计两段互补的引物,利用搭桥PCR技术扩增完整的PG-1成熟肽基因,重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成抗菌肽PG-1基因融合表达载体pGEX4T-PG-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)plyS中,筛选得到阳性克隆,并用1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE电泳图谱显示在28 kD处有特异性的蛋白条带出现,经Western blot检测表明重组子已经成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白.纯化得到的GST-PG-1用凝血酶切割后,经用亲合层析得到分子量约为2 kD抗菌肽PG-1蛋白1.38 mg/L.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽PG-1具有明显的抑菌效果.     

凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立

利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。     

适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究.     

猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白 全基因的克隆及融合表达

采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合.     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫效果评价

马链球菌兽疫亚种旧名马腺疫链球菌，多年来是引致我国猪链球菌病的主要病原。链球菌类M蛋白是一种二聚体丝状蛋白，C端为保守区域锚在细胞膜上并跨越整个细胞壁，与其它革兰氏阳性菌的表面蛋白有结构上的同源性。类M蛋白和荚膜多糖都有抗吞噬细胞的吞噬作用，有利于细菌在动物机体中生存和繁殖㈦。链球菌类M蛋白是一种良好的     

水稻条纹病毒CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及原核表达

PCR扩增获得水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）外壳蛋白（coat protein，CP）基因。分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体，构建获得了融合基因PR-CP和PR-S-CP。测序鉴定融合基因构建正确后，将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，利用SDS-PAGE电泳和Western blot对表达产物进行了鉴定。结果发现，融合基因表达产物大小与预期结果一致，且能与RSV CP抗体特异结合。说明融合基因中的RSV CP获得了正确表达，在融合蛋白中保持了自身独立的抗原活性，推断融合基因在生物体内的表达可能都能保持每个蛋白各自独立的结构和功能。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

本文重组和构建了新城疫病毒 ( NDV)融合蛋白基因 ,并对该基因进行了鉴定 :将新城疫病毒 F基因片段经 RT— PCR扩增 ,插入经 Eco R I/ Sal 酶切的克隆载体 p UC18及表达载体 p GEMEX,转化大肠杆菌 JM10 9株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆 ,再用双酶切法、核酸探针、 PCR及核苷酸序列分析法鉴定 ,表明插入成功并且阅读框架正确     

基因融合技术及其应用

基因融合技术以其快捷、高效生产多功能蛋白的优势，近年来在生物学领域中得到了愈来愈广泛的应用，结合本实验室的相关研究，简要综述基因融合技术、影响基因融合的主要因素以及融合基因的主要应用。     

链霉菌(Streptomyces ST66)MalQ基因克隆与原核融合表达

利用PCR方法获得Streptomyces ST66 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pTrc-CKS中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的Streptomyces coelicolor MalQ基因的同源性高达97%。重组质粒pTrc-MalQ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Top10F',经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与CKS(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)基因表达的融合蛋白在目标位置约106kD处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。     

Preparation of Bioactive Recombinant Chicken Leptin Fusion Protein

将鸡Leptin成熟肽的cDNA片段插入表达载体pRSET A的Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ两位点之间，构建重组表达质粒pLep -SCAU2并转化大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21（DE3）, 将重组菌在含氨苄青霉素100 μg/mL 的LB培养基中培养至OD600大于0.6之后，经IPTG 0.05 mol/L诱导表达出分子量约为17.5 kD的含6×His标记的重组鸡Leptin，诱导4 h后表达量达最高，占总菌体蛋白的25％左右,且以包涵体形式存在。该重组鸡Leptin经50％Ni-NTA树脂纯化和透析复性折叠后分离出可溶性部分。对35日龄的矮脚黄鸡腹腔注射该可溶性重组鸡Leptin（2 mg/kg 体重）；注射后60 min内的采食量与对照组差异不显著 （P > 0.05），但在注射后80~120 min都显著低于对照组（P < 0.05）。Leptin处理公鸡的采食量在注射2 h后逐渐上升并在5.5 h时与对照组公鸡相同。但Leptin处理母鸡的采食量持续受到抑制，在注射后5.5 h时仍然显著低于对照组母鸡（P <0.01）。表明所表达的重组鸡Leptin能显著抑制鸡的采食量（母鸡比公鸡效果更为明显），证明所制备的重组鸡Leptin融合蛋白具有生物学活性。     

融合基因mChIL-18/mChIFN-α克隆及其原核表达载体的构建

分别以鸡白细胞介素18成熟肽基因(mChIL-18)和鸡α-干扰素成熟肽基因(mChIFN-α)为模板,通过PCR及PCR重叠延伸技术(SOE)得到融合基因mChIL-18mChIFN-α。将融合基因克隆于pGEM-T Easy载体后,再亚克隆到原核表达载体pQE30,并进行测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的融合基因mChIL-18mChIFN-α。SDS-PAGE可检测到分子质量为39.4kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

表达外源绿荧光蛋白重组山羊痘病毒的构建及纯化

以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒 (Goatpox virus，GPV) 疫苗株为亲本，以复制非必需胸苷激酶 (tk) 基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂。利用转移载体pTK-lacZ-gfp及其与GPV发生同源重组获得的病毒(rGPV-lacZ-gfp) 验证外源基因β-半乳糖苷酶 (lacZ) 和绿荧光蛋白 (gfp) 基因在背靠背启动子p11和p7.5启动下成功稳定表达后，将转移载体lacZ基因更换为gpt (黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶) 基因 (pTK-gpt-gfp)，利用MPA阻断核酸代谢途径筛选并获得了遗传稳定表达的单一纯化病毒克隆 (rGPV-gpt-gfp)。研究建立了表达外源基因重组GPV构建系统及其克隆纯化方法，为进一步开展GPV活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。     

Fusion Expression and Purification of Marek’s disease virus Tegument Protein VP16 and Its Antibody Preparation

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus ,MDV)UL48基因编码的蛋白与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus ,HSV)衣壳蛋白VP16为同源物，将其克隆入pET-32a载体中，获得pET-VP16, 转化Escherichia coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳显示:融合蛋白获得可溶性表达，表达蛋白的相对分子量约为67 kD；将表达的融合蛋白过His·Bind柱，获得纯化的蛋白，将该蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过间接ELISA和Western blot鉴定制备的多克隆抗体的效价和特异性，结果表明，该抗体具有较高的特异性，间接ELISA效价大于2×10－5。