草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

通过碳化二亚胺法将草甘膦(Glyphosate,GLY)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明,草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为11∶1和9∶1。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体,ELISA检测抗体溶液效价为1∶1×107,该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ELISA检测方法(ciELISA),其线性范围为0.78～100μg/mL,线性回归方程为y=15.851 0 lnx+7.780 5,R2=0.993 8。草甘膦的检测限为IC10=1.15μg/mL,IC50=14.35μg/mL。在添加回收试验中,草甘膦添加值5和10μg/g时,玉米粉中的草甘膦回收率为104.12%和81.37%,小麦粉中的回收率则分别为118.94%和为109.39%。结果表明,采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ciELISA方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。     

骆驼血清中不同抗体亚型对除草剂麦草畏的性能研究

为构建麦草畏快速检测技术,本研究通过rProtein A/G Beads 4FF重力柱和rProtein G Beads 4FF重力柱对经免疫后的双峰驼体内3种亚型的IgG抗体进行分离纯化,得到常规抗体IgG1和天然缺失轻链的重链抗体IgG2和IgG3,并检测了3种不同抗体亚型对麦草畏的亲和性和特异性的差异。结果显示,IgG1、IgG2和IgG3的IC50值分别为0.11、0.10和0.19μg/mL,线性范围分别为0.002～5.47,0.012～2.97和0.013～2.98μg/mL。特异性检测试验结果显示,IgG1对麦草畏的结构类似物2,3,6-三氯苯甲酸具有一定的交叉反应,交叉反应率为52%,而IgG2和IgG3无交叉反应。IgG2和IgG3是获得高灵敏性和特异性纳米抗体的重要基础,本研究将为双峰驼体内麦草畏纳米抗体的筛选工作奠定了重要基础。     

伏马菌素B1间接竞争ELISA检测方法的建立和应用

以人工合成的抗原OVA-FB1作为包被抗原,FB1(伏马菌素B1)为竞争抗原,两者与一定量的抗FB1单抗反应,建立检测FB1的间接竞争ELISA方法,对玉米样品进行初步检测应用。结果表明,间接竞争ELISA方法最佳抗原包被浓度为196 ng/ml,包被时间为4℃过夜,单抗最佳工作浓度为1∶4 000,酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 500,最佳的抗原抗体竞争反应时间和温度为4℃过夜作用。可测最适范围为10~1 000 ng/ml,回归方程为y=1.113-0.313x,相关系数R2为-0.990,灵敏度为90.88 ng/nl,最低检测限为7.83 ng/ml,批内和批间变异系数分别为3.24%和2.45%,平均添加回收率为94.32%。     

除草剂丁草胺直接竞争ELISA检测方法研究

制备出3种不同结合比的酶标抗体,对检测条件进行了优化,建立了标记抗体固相抗原直接竞争ELISA(cdELISA)检测丁草胺的方法。结果表明,酶标抗体克分子比为1.55时偶合物活性最高,包被浓度1μg·mL-1,酶标抗体800倍稀释,稀释液采用2×PBS,不含BSA、甲醇,建立的标准曲线IC50=1.7ng·mL-1,检测限为0.006ng·mL-1,检测范围0.06～2616.7ng·mL-1,批内变系数9.25%,批间变异系数23.55%。蒸馏水以及稀释10倍后的矿泉水、池塘水、稻田水添加1ng·mL-1和10ng·mL-1的丁草胺,用所建立的方法检测,平均回收率分别为93.27%、158.50%、119.75%、124.51%。本研究为进一步开发丁草胺免疫分析试剂盒奠定了基础。     

磺胺母核抗原合成及多克隆抗体的制备

制备磺胺类药物母核结构的半抗原(H),通过免疫家兔得到多克隆抗体,为制备针对多种磺胺类药物的单抗和磺胺药检测免疫胶体金试纸条研制奠定基础。以对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)和对氨基苯甲酸甲酯(PA-BA)合成磺胺母核的半抗原(H);以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用混合酸酐法,合成了免疫原H-BSA和包被原H-OVA通过紫外光谱定性证明偶联物偶联成功与否,以H-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法对其特异性及效价进行检测。成功合成了磺胺母核人工抗原即免疫原H-BSA和包被原H-OVA,二者的蛋白浓度分别为8.46 mg/mL和10.53 mg/mL,结合比分别为13∶1和9∶1;制备的多克隆抗体特异性良好,血清效价为1∶256 000。     

克伦特罗的CLIA分析试剂盒的研制

通过制备克伦特罗（Clenbuterol,CL）人工抗原获得高活性抗体,用辣根过氧化物酶（HRP）标记CL抗原,以鲁米诺（luminol）为发光底物,建立直接竞争法检测分析盐酸克伦特罗,并对包被液、包被条件、封闭蛋白、孵育时间、酶用量等参数进行优化,成功研制出化学发光法检测CL试剂盒。该方法的线性检测范围0.1~8.1 ng·mL-1,线性相关系数r=0.996,IC50值为0.607 ng·mL-1;理论检测限小于0.1 ng·mL-1;批内变异系数6.76%~8.31%;批间变异系数7.4%;回收率（90±15）%,与莱克多巴胺等其他β-激动剂不发生交叉反应。     

呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备与鉴定

制备了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-■唑烷酮(AOZ)的人工抗原,再采用重氮法将AOZ衍生物2-NP-AOZ与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA,通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析其偶联效果。以2-NP-AOZ-BSA皮下注射免疫SPF级BALB/c小鼠,分别于3次免疫和5次免疫后制备血清,以间接ELISA检测血清中2-NP-AOZ抗体效价,间接竞争ELISA检测血清敏感性,鉴定其免疫原性。发现2-NP-AOZ分别与BSA和OVA偶联成功,获得免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA;MALDI-TOF-MS分析测得偶联率分别为7.1∶1、3.8∶1;BCA试剂盒检测2-NP-AOZ-BSA、2-NP-AOZ-OVA的浓度分别为4.9、5.2 mg/mL。间接ELISA检测3次免疫后小鼠血清抗体效价均达1∶16 000及以上,5次免疫后血清抗体效价均达1∶32 000及以上;半数抑制浓度(IC₅₀)为34.43 ng/mL,人工抗原2-NP-...     

可食性动物组织中卡巴氧残留标示物ELISA检测方法的建立

将卡巴氧残留标示物喹喔啉-2-羧酸(QCA)与γ-氨基丁酸(ABA)衍生成喹喔啉-2-甲酰胺丁酸(QCA-ABA),再与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原(QCA-ABA-BSA),将QCA与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被原(QCA-OVA),建立了猪可食性组织中QCA的间接竞争ELISA检测方法。结果表明,最优的QCA-OVA包被抗原浓度为4μg/mL,抗体稀释倍数为1∶3.2×104,最适检测范围为0.2~51.2 ng/mL,最低检测限为0.6μg/kg,对猪肌肉和猪肝脏的添加回收率为47.4%~87.7%。     

间接竞争ELISA方法快速检测猪肉组织中的氯丙嗪

[目的]本研究旨在建立一种简单、快速检测猪肉中氯丙嗪(CPZ)残留量的方法。[方法]以CPZ-牛血清白蛋白(BSA)为包被抗原,自制鼠抗CPZ单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测猪肉中CPZ含量的间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),同时优化检测条件并对该方法进行评价。[结果]采用自行制备的特异性鼠抗CPZ单克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:抗原包被稀释倍数为1∶10 000,单克隆抗体浓度为1μg·mL~(-1),酶标二抗稀释倍数为1∶1 000,最低检测限为0.51 ng·mL~(-1),线性检测范围为1.37～111.11 ng·mL~(-1)。线性回归直线方程为y=-1.252 6x+2.853 2,相关系数(R~2)为0.986 6,总变异系数(CV)为6.97%,空白猪肉添加回收率为96.90%～118.79%。[结论]建立的间接竞争ELISA方法特异性强,灵敏度、精密度、准确度和重现性良好,可用于猪肉组织中CPZ残留的快速检测。     

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明:获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度(IC10)为0.074 ng·mL-1,中抑制浓度(IC50)为60.16 ng·mL-1,线性检测范围(IC20~IC80)为0.96~1 633.60 ng·mL-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论:该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。     

Study on ELISA for detection of sulfamethazine residues

In this study, various factors of ELISA for detection of sulfamethazine residues were explored, the coating antigen was diluted to 1：400, the best coating condition was at 4℃ overnight, the working concentration of HRP-IgG enzyme conjugate was 1 ： 7 000. The pre-incubation time and incubation time was 30 min and 120 min, respectively, the substrate solution working time was 20 min. Two moL · L^-1 H2SO4 was used to stop the reaction and checked. A standard curve of direct competitive ELISA had been established to detect the sulfamethazine residues in milk. The detection limit of this method was 1.97 ng · mL^-1. The mean concentration of sulfamethazine required to inhibit 30% antibody was 7.1 ng · mL^-1. The linear range of the detection was 5-200 ng · mL^-1. The recovery ratio was between 73.20% and 91.16%. The CV% of within array and between arrays was less than 10%.     

抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]制备可以识别双酚A（BPA）的多克隆抗体。[方法]通过双酚酸（DPA）与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）以及卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原DPA-BSA和包被抗原DPA-OVA,以DPA-BSA免疫新西兰大白兔获得抗血清,并采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）检测方法对抗体进行鉴定。[结果]经紫外光谱分析,DPA-BSA和DPA-OVA制备成功。抗血清效价最高达到1∶256 000,50%抑制率（IC50）达17.2 ng/ml。[结论]该研究为建立双酚A的快速筛选方法奠定了基础。     

间接酶联免疫吸附法测定大鲵凝集素

[目的]建立基于大鲵凝集素多克隆抗体酶联免疫定量分析的方法。[方法]以大鲵凝集素为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,建立间接非竞争酶联免疫检测方法,并对该方法的精密度及准确度进行了测试。[结果]获得的抗血清效价为1∶16 000,多克隆抗体血清的最佳稀释度为1∶3 000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗最佳稀释度为1∶30 000,抗原浓度在31.25~1 000.00 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数R~20.99,板内及板间变异系数范围分别为2.50%~9.88%和2.69%~11.59%,回收率为91.5%~109.5%。分布结果显示,大鲵凝集素在躯干部肌肉组织中的含量较高。[结论]成功建立了大鲵凝集素间接非竞争酶联免疫检测方法,该方法灵敏度高,重复性好,可用于实际检测大鲵肌肉组织中的凝集素含量。     

一种新的抗多环芳烃多克隆抗体的制备（英文）

为实现环境中多环芳烃(PAHs)污染物的快速检测,制备了抗多环芳烃多克隆抗体,用于多环芳烃免疫学检测试剂盒的研制。采用活性酯法将半抗原芘丁酸(1-PBA)分别于牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,获得PBA-BSA和PBA-OVA偶联物,以PBA-BSA偶联物免疫新西兰大白兔,获得针对多环芳烃的抗血清。以PBA-OVA偶联物为包被原,间接ELISA法检测抗血清,效价为102 400,经纯化后得到多克隆抗体。采用间接竞争ELISA法绘制了针对芘的标准曲线,得到该方法的IC50值为0.06 mg/L,检出限为0.01 mg/L。与16种多环芳烃的交叉反应实验结果表明该抗体对高环PAHs的亲和力较高。反应体系中添加低于40%的甲醇对ELISA结果无影响。该抗体的制备及特性鉴定对后续多环芳烃酶联免疫试剂盒的开发奠定了技术基础。     

牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的牛轮状病毒(BRV)分别免疫鼠和兔,制备了鼠抗BRV和兔抗BRV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测BRV的双抗体夹心ELISA方法.该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:兔抗BRV IgG包被浓度为10μg·mL-1,鼠抗BRV IgG工作浓度为5 μg·mL-1,样品反应时间60 mi...     

全氟辛烷磺酸酶联免疫检测方法的研究

以人工合成的全氟辛烷磺酸免疫原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,选择包被抗原浓度为0.1μg/mL,抗体稀释度为1∶8 000,建立酶联免疫(ELISA)检测方法。交叉反应试验结果表明,除全氟癸烷磺酸和全氟己烷磺酸的交叉反应率偏高(16.2%,14.22%)外,与其他全氟化合物交叉反应率低于10%,即该抗体有较好的特异性。PFOS检测限为10μg/L,该ELISA方法的最佳工作范围在10~1 000μg/L之间,在此范围内平均回收率为101.62%,平均变异系数为2.4%,表明该方法准确度和精密度高,便于在线检测,可应用于对水体中全氟辛烷磺酸残留的酶联免疫检测。     

大型溞ChE和NAGase间接竞争和非竞争ELISA方法的比较

[目的]探索间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA法测定大型溞ChE和NAGase的试验条件及方法灵敏度。[方法]分别采用间接竞争和间接非竞争ELISA方法测定大型溞ChE和NAGase。[结果]对于ChE,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为1.466μg/m L和1∶10 000,灵敏度为7.426 7 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为5.277μg/m L和1∶8 000,灵敏度为0.163 4 ng/m L。对于NAGase,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为8.961μg/m L和1∶6 000,灵敏度为4.199 9 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为6.450μg/m L和1∶4 000,灵敏度为0.250 8 ng/m L。[结论]无论是ChE还是NAGase,间接竞争ELISA在最适抗体浓度下的检测灵敏度均高于间接非竞争ELISA,加之其操作简便,间接竞争ELISA在生物和环境样品ChE和NAGase含量检测中值得推广应用。     

牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立

[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。     

植酸酶鼠源多克隆抗血清的制备

 【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50 μg蛋白/只?次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。【结果】凝胶电泳的麸皮植酸酶只有一个条带;血清植酸酶抗体效价达1×104;半数抑制浓度达148.87 ng?mL-1。此抗血清对市售的普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩的微生物植酸酶的半数抑制浓度分别达到165.59 、163.80和166.51 ng?mL-1,交叉反应率分别为89.85%、90.88%和89.41%。100℃煮沸5 min后的麸皮、市售普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩酶半数抑制浓度分别为2 871.34、5 208.85、7 914.12和5 804.24 ng?mL-1,交叉反应率分别为5.18%、2.86%、1.88%及2.56%。【结论】制备出了具有高效价、高灵敏度和特异性的鼠源植酸酶多克隆抗体,为植酸酶单克隆抗体制备及植酸酶ELISA检测试剂盒研制奠定了基础。