青天葵EBP1基因原核表达载体的构建

[目的]构建青天葵器官大小调控基因——Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coli BL21表达宿主细胞后,分别获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。     

青天葵球茎的组织培养

[目的]通过组织培养方法获得青天葵组培苗。[方法]以青天葵的地下球茎为外植体进行组织培养,在不同生长阶段观察生长情况并记录相关数据。[结果]以MS+6-BA 5.0 mg/L作为初代诱导培养基较好;MS+6-BA 3.0 mg/L适合作为根状茎增殖培养基,根状茎用生长尖端增殖最好;不加任何激素的MS培养基适合诱导形成球茎;球茎移栽后长芽率达到83.9%。[结论]利用青天葵球茎进行组织培养,可为大面积人工栽培青天葵提供组培苗。     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

青天葵EBP1基因原核表达载体的构建(英文)

[目的]构建青天葵器官大小调控基因———Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切进行验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coliBL21表达宿主细胞后,获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。     

青天葵HMGR 基因片段的鉴定 和生物信息学分析

采用生物信息学对青天葵转录组测序获取的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段Nf HMGR及其编码蛋白进行功能鉴定和表达分析。结果表明,Nf HMGR基因片段序列长度为1 563 bp,与其他植物HMGR基因的同源性最高可达88%;编码含有521个氨基酸、分子量约为55.34 ku的亲水性不稳定蛋白。Nf HMGR蛋白具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶Ⅰ类酶功能域,归属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶超级家族,包含3处跨膜结构域,不含任何信号肽、转运肽,二级结构表现为混合型结构蛋白质。在青天葵不同组织中,Nf HMGR基因在球茎中的表达量高于在叶片中的表达量。     

药用植物青天葵的悬浮培养条件优化

以悬浮细胞干重增加率、酶活力为考察指标,研究不同培养基、光照条件、蔗糖浓度、培养基pH值对药用植物青天葵细胞生长的影响,对青天葵悬浮细胞培养方法进行条件优化。结果表明,1/4MS和1/2MS培养物外观形态最佳,1/2MS组培养物干重增加率最大,MDA含量最低,POD含量最高;暗培养条件有利于愈伤组织干重的增加;蔗糖浓度为1%时愈伤组织干重增加率显著高于其他处理组,pH6.0为青天葵悬浮培养的合适pH值,培养基中添加MES可明显提高干重增加率。     

青天葵叶片原生质体分离条件的优化

以青天葵Nervilia fordii(Hance)Schltr.的新鲜叶片为试材,对青天葵原生质体的制备分离技术进行研究。用不同浓度的甘露醇溶液处理青天葵叶片下表皮细胞,进行细胞质壁分离试验,确定青天葵叶片细胞的等渗浓度;采用正交设计研究酶解法制备青天葵叶片原生质体的最适合纤维素酶浓度、离析酶浓度及酶解时间。结果表明,青天葵叶片细胞的等渗浓度为11%甘露醇;采用1.0%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10的混合酶液酶解青天葵叶片12 h能达到很好的分离效果,获得高质量的原生质体。     

拟南芥苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙烷途径是植物体内广泛存在的次生代谢途径,此代谢过程中的第1个关键酶为苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-1yase,PAL)。苯丙氨酸解氨酶通过对基因的起始转录、频率的控制和对外界诱导因子的响应来调控基因的表达,并且其表达水平对于下游黄酮类物质的合成起着非常重要的作用。在一定条件下,苯丙氨酸解氨酶可利用其特殊的酶学性质逆向催化生产L-苯丙氨酸。通过一系列的生物信息学分析,确定拟南芥中苯丙氨酸解氨酶的存在,并进行基因的克隆及表达分析,为L-苯丙氨酸的生产提供新的物种来源。     

青天葵球茎快繁组培技术研究

以青天葵地下球茎作为外植体,探讨不同激素组合（6-BA、NAA）、培养基等对青天葵根状茎、球茎诱导或增殖的影响,以获得适合球茎繁殖的再生体系。结果表明,青天葵根状茎诱导培养基以MS＋6-BA2．0mg／L＋NAA0．5mg／L为宜,根状茎的诱导率可达60％;根状茎增殖培养基以MS＋6-BA2．0mg／L＋NAA0．1mg／L＋10％椰子汁为宜,增殖系数可达5．0;球茎诱导培养基以1／2MS＋6-BA2．0mg／L＋NAA0．1mg／L＋10％椰子汁＋0．1％活性炭最佳,诱导系数为4．0。采用直径大于1cm的球茎进行移栽,球茎发芽早、发芽率高,出苗较为整齐。     

黄芪AmPAL的生物信息学分析

[目的]为了研究黄芪苯丙氨酸解氨酶(AmPAL)基因序列的特点,[方法]本文通过生物学软件对其生物学信息进行分析。[结果]结果显示,AmPAL基因具有5’、3’UTR区,编码一个分子量为78.05kD、稳定的亲水性脂溶蛋白,此蛋白分布于细胞质中,没有发现其跨膜片段,含有较多的潜在蛋白翻译后修饰位点。以欧芹为模板用PDB数据库构建其三级结构,发现此蛋白为四聚体蛋白,具有6个保守结构域。[结论]这些参数为深入了解黄芪的AmPAL基因提供研究基础。     

�����DXR������뵰�׵�������Ϣѧ����

为后期青天葵DXR基因的全长克隆、功能鉴定和调控研究奠定基础,采用生物信息学方法对前期通过转录组测序获得的青天葵DXR基因编码蛋白序列进行分析.结果表明:NfDXR序列包含457个氨基酸,分子量约为49.72 Ku,为亲水性、混合结构型蛋白质.NfDXR属于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶超级家族,含有DXR功能域、2个NAPDH结合基序和2个DXR活性位点基序,不具有跨膜结构域和信号肽结构.NfDXR与其他单子叶植物DXR同源性高,其中与铁皮石斛DXR的序列相似度达90％.     

复方青天葵组方筛选及对猪呼吸道疾病治疗效果

文章旨在筛选复方青天葵(青天葵-A、鱼腥草-B、黄芪-C)最优组方及对猪呼吸道疾病治疗效果.采用内毒素腹腔注射法建立小鼠呼吸窘迫综合症模型;利用正交试验方法,以肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为指标筛选最优组方;向断奶仔猪日粮中添加最优组方比例高、中、低剂量复方青天葵,以氟苯尼考为对照组针对自然感染呼吸道疾病猪进行治疗.结果表明,正交组中SOD、MDA与模型组相比差异显著(P＜0.05),青天葵最优解为A1、鱼腥草最优解为B3、黄芪最优解为C2;与对照组相比,复方青天葵高、中、低剂量组分别有较高治愈率和有效率.因此,复方青天葵最优组方为:青天葵0.5 g·kg-1,鱼腥草0.1 g·kg-1,黄芪0.05 g·kg-1,最优处方比例复方青天葵针对呼吸道疾病猪有较好治疗效果.     

美洲南瓜（Cucurbita pepo）种皮苯丙氨酸解氨酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆有壳美洲南瓜种皮PAL基因（CP-PAL）,研究PAL基因在有壳和裸仁美洲南瓜种皮发育过程中的表达特性,为揭示美洲南瓜种皮发育机理及木质素积累在南瓜种皮发育中的作用等方面提供理论依据。【方法】利用RT-PCR,结合RACE技术克隆CP-PAL的全长序列并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术,采用2-△△Ct方法对种皮发育过程中PAL基因的表达进行分析。【结果】CP-PAL序列全长为1 720 bp,含有一个1 359 bp的ORF,114 bp 5′端非翻译区、236 bp 3′端非翻译区及11 bp polyA结构,可编码452个氨基酸,分子量为48.86 kD,等电点为6.55,原子总数为6 885个,分子式为C2158H3449N607O657S14。通过BLASTX比对表明CP-PAL核苷酸序列及其氨基酸序列与黄瓜PAL核苷酸及其氨基酸序列的相似性最高。CP-PAL包含PAL-HAL、PLN02457及phe_am_lyase 3个结构域及酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,属于Lyase_I_Like超家族。CP-PAL不具有导肽及信号肽,为非跨膜蛋白,可能定位于细胞质及内质网上,属可溶性蛋白。CP-PAL蛋白含有4个酪蛋白激酶Ⅱ识别位点、6个蛋白激酶C识别位点、12个豆蔻酰化位点及2个糖基化位点。此外,分析可知CP-PAL有18个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点及5个酪氨酸磷酸化位点。无规则卷曲是CP-PAL蛋白二级结构中最大量的结构元件,α-螺旋和延伸链分散于整个蛋白质中,且N-末端以无规则卷曲形式存在,C-末端以延伸链形式存在。CP-PAL氨基酸序列同挑选的其他14种植物的PAL氨基酸序列进行多重序列比较,发现功能区域的氨基酸序列较为保守,N-端的差异最大。系统进化树分析表明CP-PAL和黄瓜PAL蛋白的亲缘关系最近。CP-PAL蛋白三级结构以α-螺旋为主要结构元件,β-转角和无规则卷曲较少。实时荧光定量PCR分析表明PAL基因在有壳和裸仁美洲南瓜种皮发育中呈现反向对应的变化趋势：有壳美洲南瓜种皮PAL基因在自交授粉20 d后表达量增加,而裸仁美洲南瓜种皮PAL基因在20 d后表达量下降。整个种皮发育过程中,PAL基因在裸仁美洲南瓜中的表达量低于其在有壳美洲南瓜中的表达量。【结论】从有壳美洲南瓜种皮中克隆得到与木质素合成相关的PAL基因,该基因可能通过参与调控种皮木质素的合成从而影响美洲南瓜裸粒品种的种皮发育。     

油桐种子FADX基因的克隆和序列分析

[目的]克隆油桐种子FADX基因全长cDNA。对该基因作生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能提供参考。[方法]以未成熟的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物;采用RTPCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,应用Antheprot软件和InterProScan对该基因进行了生物信息学分析。[结果]该序列5'端和3'端非编码区序列长度分别为13、47 bp,含有1个开放阅读框(14～1 174 bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域;相对分子量是44 343.0,理论等电点为8.33。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋含量占29%,β折叠占32%,转角占6%。[结论]该蛋白属于脂肪酸脱氢酶。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建及表达分析

利用基因重组技术,以油松PAL基因(TaPAL) CDS区(2 157 bp)作为外源基因的同源重组片段,构建了pET-28a-TaPAL重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达并进行分析.经SDS-PAGE电泳检测,在分子量80 KD处获得一条特异蛋白的表达条带,且其大小与预期相符.在温度28℃,IPTG浓度1.5 mmol· L-1,时间3h条件下,重组质粒的表达量最大.可溶性分析表明,在最佳诱导条件下,该蛋白主要以包涵体形式存在.粗酶活性测定表明,粗酶(在20℃、IPTG浓度1 mm01·L-1条件下诱导10 h)比活力为55.3μmol·min-1·gpro-1,即55.3U·g-1.构建的pET-28a-TaPAL重组载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出具有生物活性的融合蛋白.     

禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 的克隆与表达分析

【目的】探究禹白芷中欧前胡素含量与苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 表达的相关性,并对 AdPAL1进行克隆和原核表达。【方法】使用高效液相色谱法测定禹白芷快速生长期和收获期根和叶中欧前胡素的含量,并使用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）方法测定 AdPAL1 基因在同时期根和叶中的表达情况,以观察欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达是否具有相关性。此外,以禹白芷转录组为基础,采用逆转录 PCR（RT-PCR）技术从禹白芷根中克隆 AdPAL1 基因,并在大肠杆菌中进行表达。【结果】禹白芷快速生长期根中的欧前胡素含量远高于叶,而 AdPAL1 基因在根中的表达量也远高于叶。与快速生长期相比,收获期根中欧前胡素含量略有下降,AdPAL1 基因在根中的表达量也同时下降。这些结果表明 AdPAL1 基因表达与欧前胡素含量具有相关性。此外,生物信息学分析显示,禹白芷 AdPAL1 基因（GenBank 登录号：OQ822236）开放阅读框长 1 764 bp,编码 557 个氨基酸,其蛋白相对分子质量为 61.10 kD,等电点为 5.92,且具有苯丙氨酸解氨酶保守结构域（IPR005922,1~547）,属于 PAL 蛋白家族成员。AdPAL1 蛋白定位于细胞质,主要由 α- 螺旋和无规则卷曲构成,与石防风属植物 KpPAL2 蛋白亲缘关系最近,序列相似性高达 99.28%。AdPAL1 基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为 84.00 kD,与预期蛋白大小一致。【结论】初步确定禹白芷根和叶中欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达相关,并成功克隆 AdPAL1 基因,在大肠杆菌中成功表达。上述结果为进一步研究 AdPAL1 基因在欧前胡素生物合成中的作用机制提供参考。