大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP14克隆与生物信息学分析

采用RT-PCR技术克隆大豆紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatase,PAP)基因,并对基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,为植物磷高效转基因育种及分子机制解析提供候选基因。结果表明:从低磷处理14d的‘中黄15’cDNA中克隆获得一条开放阅读框1 395bp的基因,经保守域分析发现该基因属于紫色酸性磷酸酶类,命名为GmPAP14(GenBank No.JN967626)。对基因编码蛋白进行生物信息学分析发现,GmPAP14编码1条含有464个氨基酸残基的多肽链,分子量约53.1kD,理论等电点6.14,且含有紫色酸性磷酸酶所特有的5个保守基序和7个金属离子结合位点。进一步分析发现GmPAP14具有跨膜结构与信号肽,定位于质膜或分泌到胞外。经系统发育树分析显示GmPAP14与苜蓿MtPAP1及大豆GmPAP1具有同源性,预测可能与植物磷素高效吸收利用有关。     

西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的克隆及分析

旨在利用基因工程手段将AeSePAP1基因转入到小麦,为获得耐低磷胁迫的小麦品种奠定基础。以西尔斯山羊草的叶片为材料,根据小麦和二穗短柄草的PAP1基因设计特异引物,采用同源克隆的方法获得西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的cDNA序列,并将其命名为AeSePAP1。该基因长1.03kb,编码335个氨基酸,分子质量为37.95ku,等电点为5.55。与小麦PAP1基因相比,西尔斯山羊草PAP1基因的cDNA的编码区有36处发生碱基替代,包括24处转换和12处颠换,有16处编码的氨基酸残基不同,其序列一致性达94.66%。对AeSePAP1基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现,该蛋白具有信号肽和跨膜结构,定位于质膜或分泌到胞外。系统进化树分析表明,西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因与普通小麦、短柄草、谷子的PAP1基因同源性较高。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。     

苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10的克隆及功能鉴定

【目的】克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10,研究其组织表达模式和低磷响应,并进一步研究MdPAP10在低磷条件下的功能,为深入研究MdPAP10在果树中参与紫色酸性磷酸酶分泌和影响磷吸收的分子机理奠定基础。【方法】本研究以‘嘎啦’苹果（Malus×domestica‘Royal Gala’）为试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10。通过NCBI分析MdPAP10的蛋白质结构并获得白梨、桃和草莓等10个物种的PAP10氨基酸序列,利用MEGA5.0构建系统进化树。利用qRT-PCR检测MdPAP10在苹果不同组织的表达情况和对低磷胁迫的响应特性。将MdPAP10连接到植物过表达载体pBI121,转化LBA4404农杆菌,用于侵染苹果愈伤组织。通过在抗性培养基上筛选和PCR鉴定,获得MdPAP10转基因愈伤组织。在低磷培养基上培养MdPAP10转基因愈伤组织检测其酸性磷酸酶积累情况以及对低磷胁迫的耐受性和磷含量。最后利用qRT-PCR检测MdPAP10转基因愈伤组织中磷相关基因的表达量。【结果】克隆获得苹果紫色酸性磷酸酶基因MdPAP10（基因序列号：MDP0000272096）,开放阅读框为1 332 bp,编码含有443个氨基酸的蛋白。蛋白质结构分析显示,MdPAP10包含一个信号肽和一个磷酸酶结构域。基因结构分析显示,MdPAP10含有5个外显子和4个内含子。进化树分析显示,苹果MdPAP10与白梨PbPAP10同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,MdPAP10在根、茎、叶、花、果中均有表达,并且在根中的表达量最高。MdPAP10对低磷条件有明显响应,在根中表达量逐渐升高,在6 h达到最大后逐渐下降;在叶中的表达量始终低于对照组。MdPAP10转基因愈伤组织在低磷条件下能够明显促进酸性磷酸酶的分泌。在低磷条件下培养转基因愈伤组织20 d发现过表达MdPAP10提高了愈伤组织对低磷胁迫的耐受性,并且提高了对磷的吸收。qRT-PCR结果显示,过表达MdPAP10能够明显促进苹果磷相关基因的表达。【结论】MdPAP10能够对低磷胁迫有明显响应,在低磷条件下能够促进磷吸收和酸性磷酸酶的分泌。MdPAP10在响应低磷胁迫过程中发挥着重要的正调控作用。     

大豆外源基因遗传转化的研究现状及展望

用于大豆遗传转化的方法有很多，如农杆菌介导法、电击/PEG电击、基因枪、花粉管通道等。本文对这些方法在大豆上近些年的研究和应用现状（大豆品质改良、抗病和抗虫等）进行了阐述，并对各种转化方法存在的不足和今后应解决的主要问题和研究目标作了概述。     

青稞酸性磷酸酶基因HvnACP2克隆和亚细胞定位研究

为了探索青稞酸性磷酸酶基因 HvnACP2的基因和蛋白结构特点,为青稞磷吸收利用机制研究提供基础。以青稞‘肚里黄’叶片为材料,根据植物基因组数据库Gramene中的大麦 HvACP2基因和启动子区域序列设计引物,通过PCR获得青稞 HvnACP2基因和启动子区域序列。采用生物信息学软件对 HvnACP2基因启动子区域元件以及蛋白理化性质、跨膜结构、磷酸化位点、信号肽、二级、三级结构进行分析。结果表明： HvnACP2有2个外显子和1个内含子,启动子区域有与分生组织、光响应、厌氧、茉莉酸和脱落酸相关的顺式作用元件。HvnACP2蛋白由454个氨基酸组成,分子质量为51 285.15 u,总原子数为7 058,亲水系数为-0.451,理论等电点为6.17,不稳定指数34.54,脂溶性指数为67.05。具有12个磷酸化位点和信号肽,不具有跨膜结构。 HvnACP2中α螺旋、延长链、β转角、无规则卷曲所占比例分别为18.72%、53.96%、23.57%、3.74%。 HvnACP2和其他物种的同源蛋白都有紫色酸性磷酸酶N末端结构域和金属酸性磷酸酶结构域,将 HvnACP2与其他植物的氨基酸序...     

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因转化大豆的研究

本研究利用农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入大豆,以提高大豆的耐盐性。对132棵转化植株进行了PCR检测,获得64棵阳性植株,阳性率达到48%。对PCR阳性植株进一步进行Southern杂交分析,证明BADH基因已经整合到大豆基因组中。     

蒺藜苜蓿紫色酸性磷酸酶MtPAP3基因在共生固氮中的功能

利用启动子组织表达定位、超表达及CRISPR/Cas9基因敲除等方法对蒺藜苜蓿酸性磷酸酶MtPAP3基因的功能进行研究。结果显示:MtPAP3在蒺藜苜蓿根和根瘤的维管束组织以及根瘤的分生区和侵染区中表达,在低磷胁迫和根瘤中均表现为特异性诱导后的高效表达;超表达MtPAP3能够显著提高蒺藜苜蓿的结瘤数及根瘤固氮酶活,敲除MtPAP3基因能显著抑制根瘤的发育及固氮酶活。结果表明:MtPAP3参与低磷胁迫条件下根瘤中的磷代谢及共生固氮过程。     

大豆外源基因遗传转化的研究现状与展望

用于大豆遗传转化的方法有很多,如农杆菌介导法,电击／ＰＥＧ电击,基因枪,花粉管通道等。本文对这些方法 在大豆上近些年的研究和应用现状（大豆品质改良,抗病和抗虫等）进行了阐述,并对各种转化方法存在的不足和今后应解决的主要问题和研究目标作了概述。     

Na~+转运蛋白SKC1基因转化大豆的研究

本研究构建了水稻Na+转运蛋白SKC1基因植物表达载体pTF-SKC1,标记基因为Bar基因。以子叶节为外植体,利用农杆菌介导法将SKC1导入大豆中。经过除草剂抗性筛选后获得的再生植株经PCR方法鉴定,转基因植株阳性率为50%,初步证明SKC1基因已整合到大豆基因组中。耐盐性试验结果表明,转基因植株的耐盐性高于对照。     

农杆菌介导的pac1基因转化大豆研究

选用高感大豆花叶病毒病而再生能力较强的大豆品种和品系作为受体,对丛生芽诱导培养基、侵染菌液的制备以及根的诱导方法进行了优化。采用优化后的遗传转化体系以农杆菌介导法将pac1导入大豆,MSB培养基中附加2 mg/L6-BA+0.2 mg/LIBA进行丛生芽诱导,液体YEB重悬活化菌体后侵染,MSB培养基中蔗糖含量15%+2 mg/LIBA+0.2 mg/L6-BA进行生根诱导。共获得8株PCR检测呈阳性植株,经SouthernBlot检测,证明pac1基因已整合到大豆基因组中。转基因植株对病毒的抗性评价正在进行中。     

新型HMW-GS基因1Dy12.1~(*t)植物双元表达载体的构建及其遗传转化

为了建立快速研究高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS)基因功能活性的植物表达体系,以自主克隆的新型HMW-GS基因1Dy12.1~(*t)为目的基因,利用限制性内切酶Xho Ⅰ和Sal Ⅰ切割后5'端能形成相同粘性末端的特性,成功构建了1Dy12.1~(*t)的植物双元表达载体pBINHP-GluT.该载体选择使用胚乳特异性强启动子,利用已知HMW-GS基因内部均不含有的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ内切酶位点引入1Dy12.1~(*t)编码区,并将1Dy12.1~(*t)的表达调控置于T-DNA区内,从而奠定了其在不同HMW-GS基因功能活性研究上的便利性.通过根癌农杆菌烟草叶盘转化研究目的基因1Dy12.1~(*t)在植物体的表达特性,SDS-PAGE和western blotting鉴定结果表明,1Dy12.1~(*t)在转基因烟草种子胚乳中得到高效表达,进一步证实了所克隆基因的正确性和所构建载体的有效性.     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

温度对黑豆萌发时酸性磷酸酯酶活力的影响研究

在不同温度下培养黑豆,提取不同萌发时期的酸性磷酸酯酶,利用福林-酚法测定其活力,研究温度对黑豆萌发时酸性磷酸酯酶活力的影响。结果表明,在15~35℃的温度范围内,黑豆在萌发时期,酸性磷酸酯酶的活力总体呈现出先上升、达到最大后又略微降低的现象。温度较高时,黑豆萌发较快,酸性磷酸酯酶达到最大酶活力所需时间较短;温度较低时,黑豆萌发过程中的最大酸性磷酸酯酶活力要低于较高温度下萌发的最大酶活力。     

CrylAb基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt CrylAb基因的高效植物表达载体pUBTB．通过农杆菌介导法导人甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT—PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

CrylAb基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt CrylAb基因的高效植物表达载体pUBTB．通过农杆菌介导法导人甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT—PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(Tu)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究。使用限制性内切酶KpnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体。通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率。580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37%。