玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4克隆及其低温胁迫下的表达模式

[目的]克隆玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4,并明确其组织表达特性及在低温胁迫下的表达模式,为深入研究SUT4基因响应低温胁迫的作用机理提供理论依据.[方法]以玉米自交系黄早四幼苗为材料,采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因,分析其生物学信息,构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其组织表达特异性及低温胁迫(4℃)下不同组织中的表达模式.[结果]克隆获得的ZmSUT4基因(GenBank登录号MK541991)全长为1621 bp,开放阅读框(ORF)长度为1506 bp,编码501个氨基酸,编码蛋白的分子量53.36 kD,理论等电点(pI)8.84,具有12个跨膜结构,定位于细胞膜上,既属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体(GPH)超家族成员,其中第25~447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守结构域,第17~484位氨基酸是GPH超家族成员的蔗糖运转子保守结构域GPH-sucrose.ZmSUT4蛋白的氨基酸序列与单子叶植物SUT4蛋白同源性较高,为86%~96%,聚集在同一分支上;与双子叶植物SUT4蛋白同源性较低,为62%~65%,说明该类蛋白在不同物种间高度保守.ZmSUT4基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,以根中的表达量最高,其次是叶,茎中的表达量最低.低温胁迫下,ZmSUT4基因在不同组织中表达量模式不同,根和叶中ZmSUT4基因表达量均在胁迫24 h达最大值,分别是低温胁迫前(0 h)表达量的2.21和2.62倍,茎中的ZmSUT4基因表达量在胁迫6 h达最大值,是低温胁迫前表达量的3.01倍.[结论]ZmSUT4基因受低温胁迫诱导表达,推测其是调控玉米响应低温胁迫的关键基因.     

不结球白菜高亲和性硝酸盐转运蛋白NRT2.2的克隆和表达分析

以不结球白菜品种"苏州青"为材料,克隆得到了1个高亲和性硝酸盐转运蛋白基因——BcNRT2.2,该基因的全长为1593 bp,编码530个氨基酸。序列分析结果表明:BcNRT2.2基因含有AGWGNMG共识别基序,其氨基酸序列与拟南芥NRT2.2的同源性为86%;其二级结构主要由α-螺旋和自由卷曲构成;预测BcNRT2.2蛋白含有12个跨膜域。实时定量PCR分析结果表明:BcNRT2.2主要在根部表达,并受高浓度硝酸盐的诱导;BcNRT2.2在原始叶片中表达量较低,但受低温、高温和干旱胁迫的诱导后而高量表达。     

不结球白菜高亲和性硝酸盐转运蛋白NRT2.2的克隆和表达分析

以不结球白菜品种"苏州青"为材料,克隆得到了1个高亲和性硝酸盐转运蛋白基因——BcNRT2.2,该基因的全长为1593 bp,编码530个氨基酸。序列分析结果表明:BcNRT2.2基因含有AGWGNMG共识别基序,其氨基酸序列与拟南芥NRT2.2的同源性为86%;其二级结构主要由α-螺旋和自由卷曲构成;预测BcNRT2.2蛋白含有12个跨膜域。实时定量PCR分析结果表明:BcNRT2.2主要在根部表达,并受高浓度硝酸盐的诱导;BcNRT2.2在原始叶片中表达量较低,但受低温、高温和干旱胁迫的诱导后而高量表达。     

谷子木质素单体生物合成基因的筛选及低氮胁迫分析

[目的]木质素在保持细胞壁结构的完整性、水分输送、机械支撑以及抵抗各种生物和非生物胁迫等起着关键作用。不同物种间木质素合成途径、木质素单体组成和含量存在一定差异。[方法]利用生物信息学手段筛选谷子（Setaria italica）中参与木质素单体生物合成的多种酶家族候选基因;利用晋谷21号的超早熟突变体xiaomi转录组数据,比较其时空表达模式,并进一步筛选各家族中的关键成员;最后,利用xiaomi低氮胁迫前后各候选基因表达差异分析,明确木质素合成途径中可能响应低氮胁迫的关键基因。[结果]本研究筛选到参与木质素单体合成的PAL、C4H、4CL、HCT、C3’H、CCoAOMT、F5H、COMT、CCR、CAD和CSE家族成员分别为10、4、6、3、1、5、1、11、13、17个,其中有21个基因被推测真正参与谷子的木质化过程,有32个基因参与谷子的低氮胁迫。[结论]谷子木质素合成关键酶家族基因的鉴定和表达分析,以及氮胁迫响应基因的筛选,为开拓通过调节谷子木质素组成,改善谷子茎秆机械强度、抗逆性能和生物质有效利用的新途径奠定了基础。     

马铃薯氮代谢对低氮胁迫的响应及转录组分析

【目的】探究不同氮效率马铃薯品种氮代谢对低氮胁迫的响应及分子机制,为马铃薯氮高效育种及高产栽培提供理论依据。【方法】以氮高效马铃薯品种冀张薯12号和氮低效马铃薯品种尤佳70为材料,采用盆栽试验方式,设置低氮（3 mmol/L纯氮）和正常施氮（15 mmol/L纯氮）处理,在出苗后30 d测定植株的干质量、氮积累量及氮代谢相关酶(硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）)活性,并依托Illumina HiSeq 2000平台进行转录组测序分析。利用DESeq进行差异基因分析,通过GO富集和KEGG Pathway数据库注释参与马铃薯氮胁迫响应的差异表达基因。【结果】2种施氮量下冀张薯12号茎叶和根系的干质量、氮积累量以及NR、NiR、GS、GOGAT活性均高于尤佳70。与正常施氮相比,低氮胁迫下2个马铃薯品种茎叶和根系的干质量、氮积累量及叶片的NR和NiR活性均显著降低,根系的GS活性显著提高;尤佳70叶片的GS活性、GOGAT活性和根系的GOGAT活性均显著降低,冀张薯12号根系的NiR活性显著降低。转录组分析结果表明,在2个施氮量对比组中,尤佳70叶片和根系中的差异表达基因分别有6 173个和249个,冀张薯12号叶片和根系中的差异表达基因分别有3 455个和1 990个。GO和KEGG结果显示,冀张薯12号的差异基因主要涉及氮代谢、氨基酸代谢等生物过程,尤佳70的差异基因主要涉及光合作用等生物过程。尤佳70和冀张薯12号根系中富集到氮代谢通路的差异基因分别有1个和8个,叶片中分别有11个和8个。尤佳70和冀张薯12号叶片的氨基酸相关代谢途径中涉及上调差异表达基因最多的均是苯丙氨酸代谢,其中编码苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸-CoA连接酶的基因表达显著上调。【结论】在低氮条件下,氮高效品种冀张薯12号氮代谢相关酶活性较高,能减缓低氮胁迫对氮代谢的影响,进而保证较高的氮效率。     

杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆杜梨硝酸盐高亲和性转运酶NRT2基因。[方法]以杜梨叶片为试验材料,采用CTAB法提取总RNA,反转录成c DNA,运用3'-RACE和5'-RACE技术,克隆获得杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因的全长,并运用生物信息学技术对硝酸盐转运酶NRT2基因进行了分析。[结果]杜梨硝酸盐转运NRT2基因c DNA全长为1 422 bp,可编码473个氨基酸,分子式为C2346H3631N589O637S26,相对分子质量为51 112.7,等电点(p I)为7.03。[结论]该试验为进一步研究梨氮素代谢提供了基础资料。     

低氮胁迫下MdCYS基因的表达分析

为了初步探究cystatins(CYS)基因参与苹果氮胁迫的调控机制,以苹果矮化砧木M.26盆栽苗为试材,分析低氮胁迫下M.26的生长量、总叶绿素质量分数、净光合速率的变化,并利用qRT-PCR技术分析苹果CYS基因表达的变化。结果表明,低氮胁迫处理与正常对照组相比,低氮处理组的株高、茎粗、总叶绿素质量分数和净光合速率均显著降低;实时荧光定量PCR分析显示,MdCYS1、MdCYS8、MdCYS15、MdCYS20、MdCYS21和MdCYS26迅速响应低氮胁迫,表达量被显著上调。生理指标与MdCYS基因关联分析结果显示:苹果CYS基因参与低氮胁迫应答,可能影响苹果对低氮胁迫的耐受性。     

甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因ScTDT克隆与表达分析

【目的】克隆甘蔗液泡膜二羧酸转运蛋白基因（ScTDT）,并分析其在甘蔗不同组织及在铝胁迫下的表达模式,为深入研究该基因功能及抵抗铝胁迫的分子机制提供理论依据。【方法】利用同源克隆技术从甘蔗品种ROC22中克隆ScTDT基因,利用生物信息学软件进行序列分析,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在甘蔗不同组织（根、茎和叶）及在铝胁迫（0、10和20μmol/L Al3+）下的表达水平。【结果】克隆获得的ScTDT基因,开放阅读框（ORF）全长1623 bp,编码540个氨基酸残基,蛋白相对分子量57.34 kD,理论等电点（pI）5.77,为不稳定的疏水蛋白,可能定位于质膜、液泡和/或高尔基体,其氨基酸序列与高粱（XP_002460443.1）、水稻（XP_015612609.1）和玉米（PWZ04635.1）的TDT氨基酸序列具有高度相似性,其中与高粱的TDT氨基酸序列相似性最高,达96.30%,说明ScTDT与高粱TDT的亲缘关系最近。ScTDT基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,但根中表达量显著高于茎和叶（P< 0.05,下同）。在铝胁迫处理下,3个甘蔗品种（ROC22、柳城05-136和中糖1202）的根中ScTDT基因表达量较对照组（0μmol/L Al3+）均显著升高,尤其是柳城05-136和中糖1202随着营养液中Al3+浓度增加,ScTDT基因的表达量呈显著升高趋势,说明高浓度Al3+胁迫更能诱导ScTDT基因高效表达。3个甘蔗品种中,以中糖1202的ScTDT基因表达量变化最大,柳城05-136次之,以ROC22的变化最小。【结论】克隆获得的ScTDT基因表达具有组织特异性,在根中高效表达可能与甘蔗抵抗铝胁迫相关,即植株通过上调根中ScTDT基因表达,从而加快液泡中苹果酸的释放,促使苹果酸从根中分泌到土壤与Al3+反应,从而减少铝毒害,表明ScTDT基因可能参与甘蔗抵抗铝胁迫,且不同甘蔗品种的抗铝胁迫能力有所不同。     

牦牛葡萄糖转运蛋白和单羧酸转运蛋白基因的克隆测序及在肌肉中的表达

采用RT-PCR方法克隆九龙牦牛(Bos grunniens)肌肉中葡萄糖转运蛋白(GLUT)和单羧酸转运蛋白(MCT)基因GlUT4、MCT1和MCT4的cDNA序列,并与普通牛(Bos taraus)进行基因序列和肌肉中mRNA水平的比较,以探索牦牛适应高原低氧的分子基础。结果表明,GlUT4、MCT1和MCT4的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与普通牛的相似性均在99.5%以上。实时荧光定量PCR分析显示,成年九龙牦牛与黄牛背最长肌中GLUT4、MCT4基因mRNA水平无差别,而牦牛PMCT1基因mRNA水平显著低于黄牛(P0.05)。乳酸脱氢酶(LDH)总活力和同工酶谱测定结果表明,牦牛背最长肌中LDH总活力、LDH5比例显著高于黄牛,显示出更强的无氧酵解能力。结合MCT1基因mRNA水平的差异发现,牦牛背最长肌对乳酸的氧化代谢能力低于黄牛,更倾向于无氧酵解,与其适应高原低氧有关。     

低温胁迫对番茄RNA解旋酶SlDEAD34基因表达的影响

利用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术对番茄RNA解旋酶SlDEAD34的蛋白结构特征、SlDEAD34基因的组织表达模式和低温胁迫条件下的基因表达情况进行了研究。结果表明,SlDEAD34包含9个保守基序,是DEAD-box型RNA解旋酶,与拟南芥LOS4高度同源,三维结构非常类似;SlDEAD34基因在生长6周的番茄根、茎和叶中均有表达,且根茎叶,在生长5个月的番茄9种组织器官中均有表达,其中在果实中表达量最高,在根中表达量最低;4℃处理时,番茄根中SlDEAD34基因下调明显,叶中表达量变化不明显,12℃处理时,番茄根和叶中SlDEAD34基因表达量变化均不明显。DEAD-box型RNA解旋酶SlDEAD34经低温4℃处理后基因表达量明显下调,暗示SlDEAD34基因响应低温胁迫,推测SlDEAD34基因可能参与调控低温逆境胁迫过程。     

火龙果己糖转运蛋白基因克隆及生物信息学分析

[目的]己糖转运蛋白(Hexose Transporter,HXT)是一种单糖转运蛋白,能够跨膜转运甘露糖、果糖和葡萄糖等己糖类物质,参与花粉发育和植株生长,进而决定果实的内在品质.分析火龙果HXT基因生物信息学及表达特性,可为调节火龙果果实品质奠定基础.[方法]通过基因克隆得到1个火龙果已糖转运蛋白基因,应用NCBI...     

铵氮和硝氮胁迫下金鱼藻对氮素的利用

对剑湖优势沉水植物金鱼藻进行不同浓度的铵氮和硝氮耐受试验,同时对植物体内的总氮、硝氮、铵氮和可溶性蛋白含量进行测定和比较。结果显示,环境中的铵氮和硝氮直接影响金鱼藻对氮素的吸收利用,和对照相比,金鱼藻的总氮含量都有明显的升高,但是浓度对总氮含量影响不明显。金鱼藻对环境铵氮较敏感,环境中高浓度的铵氮会抑制氮素的转化。金鱼藻对硝氮的耐受能力较强,环境中低浓度的硝氮会促进金鱼藻对硝氮的吸收和转化,环境硝氮浓度达到60 mg/L时,金鱼藻对硝氮的吸收达到饱和,可溶性蛋白含量达到一定水平后不再随环境硝氮浓度增加而增加。     

辣椒CaCBF1A基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

为揭示Ca CBF1A基因在辣椒抗逆机制中发挥的功能,对辣椒Ca CBF1A基因进行克隆与分析。以豫椒101为材料,根据参考基因组序列设计引物,通过PCR技术从辣椒基因组c DNA中获得CBF基因Ca CBF1A。经生物信息学分析,该基因具有一个完整的ORF(471 bp),编码156个氨基酸。Ca CBF1A编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析,预测其定位在叶绿体中,存在跨膜结构。荧光定量PCR检测结果表明,低温、高温和盐胁迫均可诱导Ca CBF1A基因的表达,其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明Ca CBF1A是一个逆境胁迫快速响应基因,推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。     

香蕉叶片低温胁迫下差异表达cDNA消减文库的构建

为了解析香蕉寒害的分子机理,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehy bridization,SSH)成功构建了香蕉叶片在低温胁迫下与未处理的差异表达的cDNA消减文库,并通过经蓝、白斑筛选,克隆测序及序列分析,以及应用半定量PCR技术对随机选取的No.28基因片段进行表达分析等方法,初步分析了实验所构建的cDNA消减文库。结果表明,实验所构建的cDNA消减文库为低温胁迫特异表达的cDNA消减文库;测序及序列分析的结果暗示可能有相当多的未知功能基因参与了香蕉抗寒的过程;随机选取的No.28的表达分析检测结果证实,通过对构建的cDNA消减文库的全面分析,有可能获得一批低温胁迫诱导特异表达的新基因,尤其对其功能的深入了解,将为全面解析香蕉寒害的分子机理、寒害过程中的信号转导打下理论基础。     

香蕉果实乙烯受体基因克隆及其表达特性

 【目的】分析香蕉果实成熟及贮藏冷害下乙烯受体基因的表达特性,探讨热处理（38℃,3 d）提高果实耐冷性与乙烯受体基因表达的关系。【方法】根据已报道的ETR基因的氨基酸保守序列设计引物,以香蕉果皮总RNA为模板,利用RT-PCR方法克隆香蕉的ETR cDNA,采用Northern杂交分析该基因的表达特征。【结果】香蕉果实在自然成熟进程中,两个基因在果皮和果肉中呈现不同的表达模式：果皮和果肉中Ma-ETR1的表达随果实成熟而逐渐减弱,而Ma-ERS3的表达仅在果实成熟后期略有增强;外源丙烯处理和38℃高温抑制果皮和果肉中Ma-ETR1的表达,却促进了Ma-ERS3的表达;低温促进果皮中Ma-ETR1和果肉中Ma-ERS3的表达,而38℃热处理3 d后则能抑制果皮中受低温诱导的Ma-ETR1表达的增强。【结论】外源丙烯和38℃高温正调控Ma-ERS3表达,负调控Ma-ETR1表达;38℃热处理3 d提高采后香蕉果实耐冷性与抑制低温诱导的果皮中Ma-ETR1表达的增强有关。     

毛果杨全基因组硝酸根转运蛋白家族(NRT2s)序列分析

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardttii)高亲和性硝酸根转运蛋白(NRT2s)为对照,对毛果杨(Populus trichocarpa)NRT2s家族成员进行序列比对、系统发育分析、基因结构分析、理化性质预测、疏水性与跨膜区预测、结构域检测等生物信息学分析。结果表明:毛果杨基因组包含6个NRT2s家族成员并可分为3个亚家族。其中PtNRT2.1、PtNRT2.2和PtNRT2.3属于亚家族I;PtNRT2.4和PtNRT2.5属于亚家族II;PtNRT2.6属于亚家族III。亚家族I保守程度最高,亚家族II和III可能由亚家族I进化而来。所有的NRT2s都具有高度相似的结构域、功能区和基因结构,在不同物种中的进化较为保守。不同的NRT2s成员定位于不同的亚细胞结构中,其具体功能可能存在差异,并共同参与调控杨树的硝态氮平衡。     

陆地棉COR基因在低温胁迫下的表达分析及功能鉴定

【目的】分析低温胁迫条件下陆地棉中COR家族成员的表达特性,研究参与低温胁迫信号途径的COR基因。【方法】通过Real-time PCR分析低温胁迫条件下,陆地棉COR基因家族成员的表达情况,利用VIGS技术鉴定响应低温胁迫的COR基因功能。【结果】对8个COR基因家族成员在低温条件下的表达分析显示,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因受低温诱导表达水平不断上调,并在处理48 h后表达量较对照上调了近9倍;与之相反,基因序列号为Gh_D06G0147的COR基因在低温诱导3 h左右表达水平出现短暂的上调,但随后其表达受到显著抑制。其余COR基因家族成员的表达受低温胁迫表达水平发生改变,但是随着胁迫时间的增加,转录水平与对照无明显差异。利用VIGS技术在棉花中沉默候选COR基因Gh_D12G0215,并将基因沉默后的棉苗与对照共同进行低温胁迫处理,在相同的处理条件下,Gh_D12G0215基因沉默后的植株与对照相比,对低温胁迫更为敏感,基因序列号为Gh_D12G0215的COR基因可能参与棉花耐低温的调控。【结论】在低温胁迫条件下,陆地棉中部分COR基因的表达受低温胁迫诱导,在陆地棉受到低温胁迫时发挥功能。     

仿刺参7个盐度相关基因在低盐胁迫下的表达模式

从仿刺参Apostichopus japonicus低盐转录组数据库中选取肌腱蛋白-R1 (TN-R1）、肌腱蛋白-R2(TN-R2)、乙酰胆碱受体亚基α-3(CHRNA3）、脂肪酸结合蛋白6(FABP6)、单羧酸转运蛋白2(SLC16A7)、纤维胶凝蛋白1 (Fcn1)、黑素转铁蛋白(Mfi2)共7个盐度调节相关基因, 利用 qRT-PCR 技术分析这7个基因在低盐胁迫下不同组织中的表达水平及表达丰度。结果表明TN-R1基因在仿刺参体腔液中表达水平最高,呼吸树次之,肠表达较低;TN-R2基因在仿刺参体腔液中表达水平最高,在肠中表达较低,呼吸树中不表达。SLC16A7、FABP6、Fcn1、CHRNA3和Mfi2均在体腔液中表达最高。Mfi2基因在体腔液中明显上调表达,在呼吸树组织和肠组织中下调表达,且与对照组均呈显著性差异。Fcn1在体腔液中的表达量在胁迫后1.5 h达到最高,为对照组的669倍,在胁迫48 h之前均呈明显上调。低盐胁迫下这7个基因表达丰度的变化,说明这些基因或作为功能基因直接参与机体的盐度适应的代谢调节,或作为调控基因调节盐度相关功能蛋白的表达和活性来提高仿刺参对低盐胁迫的耐受能力。上述结果表明仿刺参的盐度适应过程是一个需要多基因参与的应激反应信号转导网络,为仿刺参盐度调节适应机制的研究奠定基础。