鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株，HZ96)VP2基因的质粒PBS为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．5kb左右长的VP2基因产物；用Kpn Ⅰ和SalⅠ酶切纯化的PCR产物；将纯化的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301水稻胚乳特异性启动子GTl下游，并经PCR、酶切和测序鉴定．植物重组表达栽体经三亲交配已导入根癌农杆菌中．     

幼鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株 VP2基因的克隆和分析

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），扩增并克隆传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）SH9901 VP2基因，并对其进行全序列测定。结果表明，克隆到的VP2基因序列长1.3kb；强毒株SH9901 VP2片段与超强毒株OKMY高度相似；核苷酸与氨基酸同源性分别为99.26％，99.8％。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价

为提高原核表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白纯度,在大肠杆菌中表达VP2蛋白,并对其进行纯化方法优化及其免疫原性分析。利用琼脂扩散试验(AGP)测定VP2蛋白效价并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;采用饱和硫酸铵溶液和离子交换层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化填料、洗脱液离子强度及缓冲液的pH值进行优化,以确定最佳纯化条件。将纯化的VP2蛋白免疫SPF鸡,定期采血用ELISA方法测定其免疫抗体并进行病理组织检测。SDS-PAGE及Western blot鉴定结果显示,VP2分子质量约为50 ku,且具有良好反应原性,VP2蛋白可溶性表达的AGP效价为1∶16。纯化结果显示,利用强阴离子层析优化盐离子浓度及pH值可获得纯度较高的VP2蛋白,其质量浓度为0.6 mg/mL。纯化的VP2蛋白加商业佐剂免疫鸡28 d后,鸡产生的特异性免疫抗体滴度最高,且攻毒后的保护率可达到80%,法氏囊无明显病理组织损伤。综上,利用大肠杆菌成功表达了VP2蛋白,纯化的VP2蛋白纯度较高且具有良好的免疫原性。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.     

传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的免疫原性研究

 将传染性法氏囊病病毒弱毒株 (IBDV JD1)和强毒株 (IBDV ZJ2 0 0 0 )的基因组A节段全长cDNA、多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)和主要宿主保护性抗原 (VP2 )基因 ,分别克隆入两种真核表达载体pCI和 pcDNA3,构建成 12种真核表达质粒。将制备的DNA疫苗以 2 0 0 μg的剂量经腿肌和皮下结合途径首免 14日龄SPF鸡 ,2 8日龄以相同的剂量二免 ,二免后 14d攻击IBDV标准强毒BC6 / 85株。结果表明 ,含A节段或多聚蛋白基因的表达载体均能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护 ,多聚蛋白基因构建成的DNA疫苗与弱毒苗B87的免疫效果相当 ;编码VP2基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体 ,几乎不能提供免疫保护 ;以 pCI为表达载体的免疫效果优于pcDNA3;源于ZJ2 0 0 0株基因构建成的DNA疫苗诱导的免疫反应优于JD1株 ,提示DNA疫苗的免疫效果与VP2蛋白的构象、表达载体的调控元件和毒株差异等因素有关。     

家蚕表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的免疫原性初步研究(英文)

在家蚕培养细胞及幼蚕中表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）主要宿主保护性抗原VP2蛋白的基础上,初步研究了该表达产物的免疫原性。Western免疫印迹和ELISA均检测到春蚕和秋蚕中的VP2蛋白活性。含VP2的春蚕蚕血制成的注射疫苗皮下注射18日龄非免疫鸡,两周后二免;含VP2的秋蚕蚕血冻干制成口服疫苗,隔天喂服18日龄非免疫鸡。于首免后第10,13,21,28,37日分别采血,第37日攻毒。病毒血清中和试验显示注射组及口服组的中和抗体滴度最高可达1∶4211.3和1∶3118.9,攻毒结果显示它们对IBDV中国标准强毒株BC6/85的攻击保护率为100%和80%。以上研究表明家蚕表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,从而为开发实用化低成本的疫苗打下了扎实基础。IBDV亚单位疫苗的口服免疫有效是一个重要发现。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白的表达及间接 ELISA抗体检测方法的建立

建立以传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白为诊断抗原的传染性法氏囊病(IBD)血清学检测方法,研究了VP2蛋白的编码基因,并在原核表达系统中表达了VP2蛋白。用表达的VP2蛋白建立了IBDV间接ELISA检测方法。抗原最佳包被量为每孔174.67 ng,血清最佳稀释度为1:40。对采自安徽部分地区的979鸡血清样品进行检测,IBDV抗体阳性率为39.73%。结果证实,间接ELISA法用于IBD血清抗体的监测具有良好的特异性,是一种快速简便的血清学方法,值得在基层推广应用。     

传染性囊病病毒VP2蛋白诱导细胞凋亡的研究

在体外分别构建了3种重组表达质粒，含传染性囊病病毒GZ911株VP2基因的pGVP2、含HK46株VP2基因的pHVP2以及含HK46株5‘-端序列（包括非编码区，VP5和VP2基因）的pHVP2 5用不同的重组质粒转染质代鸡胚成纤维细胞（CEF），在转染后0、14、38h，收集对照组和转染组细胞，用酶联免疫吸附试验检测CEF中降解DNA量，结果，在14和38h，各组细胞中测得的Dλ值均为转染pHVP2 5组最大，其次为转染pHVP2,pCVP2的组，并都大于其他对照组，表明2个IBDV毒株的VP2蛋白在CEF中表达后都能诱导CEF发生凋亡，但不同毒株的VP2蛋白诱导CEF凋亡的能力不则；VP5蛋白可增强VP2蛋白诱导CEF凋亡的作用。     

鸡传染性法氏囊病诊断

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的禽的一种淋巴组织坏死为特征的急性、接触性传染病.目前IBD在世界范围内呈广泛流行.近几年来在新疆地区时有流行,波及乌鲁木齐、昌吉、玛纳斯、克拉玛依、库尔勒、吐鲁番等地.1992年春,阿拉尔垦区某鸡场的小鸡突然大批发病,经临床症状、病理学、细菌学、病毒学等检查确诊为鸡传染性法氏囊病.1 发病情况及临床症状发病鸡大多在1月龄,个别鸡群1个半月龄.垦区13团某鸡场养殖40日龄鸡1100多只.发病300多只,发病率27%,死亡110只,死亡率10%,病鸡羽毛杂乱、蓬松、口渴、眼闭或半闭、战粟、脱水、眼窝凹陷,采食减少,精神萎顿.下痢,排水样稀粪.     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

传染性法氏囊病毒VP_2在酵母细胞内的高效表达及其免疫原性研究

 应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好的载体pPICVP2 用SacI内切酶线性化后 ,转染酵母PichiapastorisGS115细胞 ,经PCR鉴定 ,筛选出 5 0多个重组子。分别用甲醇诱导后 ,经SDS PAGE凝胶电泳、琼脂扩散试验、Dot ELISA检测 ,得到 9个不同程度表达 4 1kuVP2 活性蛋白的阳性重组子。经凝胶薄层扫描仪分析 ,表达蛋白占酵母细胞总蛋白的最高比率为 16 % ,表达量为 0 .6 2 0 8g·L-1。表达产物免疫SPF鸡可诱导产生特异性抗体 ,并能保护鸡抵抗超强毒致死性攻击 ,具有良好的免疫原性。     

IBDV地方野毒株(XX株)VP2基因高变区的克隆与序列分析

参考GenBank发表的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了1对特异扩增IBDVVP2基因高变区的引物。应用RT-PCR法,对分离于新乡地区典型发病鸡群的IBDV(XX株)进行了VP2基因高变区的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,XX株与超强毒株UK661,OKYM高度相似,核苷酸同源性分别为98.73%,99.15%,氨基酸同源性都为100%,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

鸡传染性法式囊病毒VP2原核表达蛋白的纯化和复性

[目的]探讨鸡传染性法式囊病毒(IBDV)VP2原核表达蛋白的纯化和复性。[方法]对原核表达的IBDVVP2蛋白进行可溶性与不可溶性分析,并利用溶菌酶、Triton-100、尿素等试剂进行纯化和复性,对复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA。[结果]可溶性与不可溶性分析的结果表明,蛋白主要以包涵体形式存在。Dot-ELISA表明,复性后蛋白的反应活性增强了10倍,对复性后的蛋白与IBDV16株单抗进行Dot-ELISA,其中有11株与其发生特异性反应。[结论]复性后的蛋白与鸡传染性法式囊病毒单克隆抗体的反应性明显提高。     

鸡传染性法氏囊病病毒河南分离株HeYD VP2基因高变区基因克隆及序列分析

为初步确定新分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)河南株HeYD的毒力,根据GenBank数据库中已报道的IBDV基因组序列,设计合成了1对VP2基因高变区特异性引物,应用RT-PCR方法对分离自河南省某发病鸡场的IBDV野毒株HeYD的VP2基因高变区进行了基因克隆及序列分析,并与其他参考毒株高变区进行了序列比对,序列...     

IBDV VP2蛋白P22表位多肽的原核表达及初步鉴定

为了进一步了解传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白P22多肽抗原表位的功能,根据IBDVVP2蛋白的三维结构,设计合成编码P22多肽的基因序列,通过大肠杆菌密码子优化,并将基因序列P22串联二次合成并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。用IPTG诱导P22基因的表达。表达纯化后的P22多肽经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析及传染性法氏囊病毒快速检测试纸条检测。结果表明,P22表位多肽的分子质量约为16kD,并能被His单抗识别,用试纸条检测纯化的P22多肽,呈阳性反应结果。提示IBDV VP2蛋白P22多肽能与IBDV单抗特异性反应。     

鸡传染性法氏囊病毒河南Xin-1株VP2基因的克隆与鉴定

应用反转录(RT-PCR)技术从河南传染性法式囊发病鸡中总RNA克隆出1461bp的VP2基因,并将其克隆于pGEM-T载体,筛选并构建了pT-VP2克隆载体。序列分析表明,该VP2基因及推导氨基酸序列与日本和欧洲超强毒株序列有较高的同源性,特征性氨基酸变异相似,进化分析也表明Xin-1毒株与欧洲超强毒株UK661和日本超强毒株OKYM位于同一进化分支,提示Xin-1株病毒可能为超强毒株。     

鸡传染性法氏囊病病毒福建株的分离与初步鉴定

从临床表现胸腿肌出血、法氏囊肿大出血为主要特征的病死鸡肝脾和法氏囊中分离到1株病毒（IBDV—FJ）。结果表明,该分离病毒无血凝性,在琼脂扩散试验中能与抗IBDV特异性血清出现1条清晰的白色沉淀线;人工感染28日龄雏鸡出现与临床一致的病变。并回收到病毒;应用针对IBDVVp3基因的特异性引物进行RT—PCR,能扩增到长度为1041bp的特异性目的片段;序列分析发现分离毒vp3基因与IBDv超强毒和经典毒株的核苷酸同源性分别为97．7%-98．2％和95．2％。初步鉴定该分离毒为鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株。