传染性法氏囊病毒VP2蛋白的高效表达与免疫原性分析

为了实现传染性法氏囊病毒(IBDV)B87毒株VP2蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,将IBDV B87毒株VP2基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒p ET28a-VP2,将其转化不同大肠杆菌基因工程菌株,通过IPTG诱导表达VP2外源蛋白。利用鸡传染性法氏囊病抗原快速检测试纸筛选,确定了BL21(DE3)为VP2可溶性蛋白的高效表达菌株。SDS-PAGE、Western blot分析表明,VP2实现了可溶性表达,且可溶性VP2蛋白具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白利用琼脂扩散试验(AGP)分析,结果表明,VP2蛋白的AGP效价达到1∶64。将重组蛋白免疫接种SPF鸡,制备的抗血清AGP效价可达1∶16,说明表达的B87毒株VP2蛋白免疫原性良好。     

36株鸡传染性法氏囊病病毒中国分离株(2009~2012)VP2基因高变区的序列分析（英文）

[目的]鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种高度接触性免疫抑制性传染病。IBDV易变异,给防控提出了挑战。持续监测IBDV的流行十分必要。[方法]对36株源于2009~2012年我国10个省的IBDV毒株的VP2部分基因(包含高变区)进行了扩增、测序。将其与本实验室早期分离的18株IBDV,以及源自我国和世界其它地区的24株参考毒株,进行序列比对分析。[结果]IBDV经典毒株、变异毒株、弱毒株和超强毒株(vv IBDV)在我国同时存在。vv IBDV仍然是我国的主要流行毒株,而且新的亚群正在形成。序列比对分析显示,这些毒株中存在可能与毒力和抗原变异相关的氨基酸突变。[结论]该研究有助于笔者进一步认识IBDV的遗传变异。     

传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的免疫原性研究

 将传染性法氏囊病病毒弱毒株 (IBDV JD1)和强毒株 (IBDV ZJ2 0 0 0 )的基因组A节段全长cDNA、多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)和主要宿主保护性抗原 (VP2 )基因 ,分别克隆入两种真核表达载体pCI和 pcDNA3,构建成 12种真核表达质粒。将制备的DNA疫苗以 2 0 0 μg的剂量经腿肌和皮下结合途径首免 14日龄SPF鸡 ,2 8日龄以相同的剂量二免 ,二免后 14d攻击IBDV标准强毒BC6 / 85株。结果表明 ,含A节段或多聚蛋白基因的表达载体均能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护 ,多聚蛋白基因构建成的DNA疫苗与弱毒苗B87的免疫效果相当 ;编码VP2基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体 ,几乎不能提供免疫保护 ;以 pCI为表达载体的免疫效果优于pcDNA3;源于ZJ2 0 0 0株基因构建成的DNA疫苗诱导的免疫反应优于JD1株 ,提示DNA疫苗的免疫效果与VP2蛋白的构象、表达载体的调控元件和毒株差异等因素有关。     

传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。     

传染性法氏囊病基因工程疫苗研究进展

综述了导致近年来传染性法氏囊病(IBD)疫苗免疫发生重大变化的主要原因,即:传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株的出现和IBDV分子生物学研究和分子克隆技术与手段的长足进步.介绍了目前IBD基因工程疫苗的4种主要类型:活病毒疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗、可食用转基因植物疫苗.     

应用重组杆状病毒表达的IBDV VP2抗原建立其抗体监测方法

应用B ac-to-B ac杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株VP 2基因的重组杆状病毒reB acm id-VP 2蛋白,建立抗IBDV血清抗体的间接EL ISA检测方法,研究IBDV VP 2蛋白的结构与功能。结果表明:该方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示,其敏感性为93.4%,特异性为90.9%;对VP 2亚单位疫苗免疫的血清样本的8次重复检测,变异系数小于4%,表明该检测方法对VP 2亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白的表达及间接 ELISA抗体检测方法的建立

建立以传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白为诊断抗原的传染性法氏囊病(IBD)血清学检测方法,研究了VP2蛋白的编码基因,并在原核表达系统中表达了VP2蛋白。用表达的VP2蛋白建立了IBDV间接ELISA检测方法。抗原最佳包被量为每孔174.67 ng,血清最佳稀释度为1:40。对采自安徽部分地区的979鸡血清样品进行检测,IBDV抗体阳性率为39.73%。结果证实,间接ELISA法用于IBD血清抗体的监测具有良好的特异性,是一种快速简便的血清学方法,值得在基层推广应用。     

传染性法氏囊病重组细菌活疫苗的免疫试验

将含传染性法氏囊病(IBD)病毒VP2基因重组质粒pET28a/VP2的大肠杆菌BL21在体外诱导表达后给鸡接种.试验鸡分为9组.接种液每毫升含2.0×1010个细菌,口服3次.在21、35日龄以琼脂免疫扩散试验检测抗IBDV血清抗体;在35日龄以标准强毒株BC6/85进行攻毒;根据攻毒后法氏囊的IBDV抗原阳性数和法氏囊病变发生数统计其免疫保护率.结果表明,该疫苗诱导鸡只产生抗IBDV免疫力与接种途径、剂量、接种次数密切相关;口服接种不能诱导鸡只产生抗IBDV的免疫力;该重组细菌进入体内后不再表达VP2.     

荧光定量RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株的出现给该病的防控带来了新的困难,有效鉴别IBDV超强毒株对IBD的防控有着积极意义.根据IBDV VP4基因的保守序列,设计了一对通用引物RPa/RPb,特异性扩增IBDV VP4基因720 bp的目的片段.根据超强毒株和经典毒株VP4基因序列的差异,分别合成了FAM标记的超强毒荧光探针和JOE标记的经典毒荧光探针,建立了实时荧光RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株的方法.检测超强毒和经典毒的敏感性分别可达420和320个拷贝数.建立的实时荧光RT-PCR方法敏感性高、特异性强,可用于临床样品中IBDV超强毒和经典毒的鉴别诊断.     

乌鸡传染性法氏囊病毒的分离鉴定与分子生物学特性研究

从一群精神不振、拉白色稀粪便为特征的乌鸡中分离到 1株病毒。经血清学试验、鸡胚接种试验、动物回归试验等鉴定为法氏囊病毒。该病毒与鸡法氏囊病毒的血清型无明显差异。根据IBDV的VP2基因序列设计了一对特异性引物 ,应用RT -PCR法从中扩增出了一条0 .72kb的VP2基因高变区片段。序列分析表明 ,片段长 0 .72kb ,编码 2 4 0个氨基酸 ,与其他毒株的VP2基因序列比较分析 ,该毒株符合IBDV超强毒的特征。虽然有 4处氨基酸发生了变化 ,但没有引起其抗原性的改变     

The circulation of unique reassortment strains of infectious bursal disease virus in Pakistan

Infectious bursal disease(IBD), caused by IBD virus(IBDV), is one of the most devastating and immunosuppressive diseases of the poultry and has been a constraint on the sustainable poultry production around the globe including Pakistan. While the disease is threatening the poultry industry, the nature of predominant strains of IBDV in Pakistan remained ill-defined. In this study, an epidemiology survey was conducted in the main chicken-farming regions of Pakistan. The batch of Pakistan IBDVs genes simultaneously covering both VP1 and VP2 were amplified, sequenced, and analyzed. The unique segmentreassortant IBDVs(vv-A/Uniq-B), carrying segment A from vvIBDV and segment B from one unique ancestor, were identified as one important type of circulating strains in Pakistan. The data also discovered the characteristic molecular features of Pakistan IBDVs, which will contribute to scientific vaccine selection and effective prevention of the disease.     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

IBDV VP2/4/3、ChIL-18共表达载体的构建及在Vero细胞上的表达

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)DNA疫苗的免疫效果,应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension)将IBDV VP2/4/3基因与鸡白细胞介素18(ChIL-18)基因分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-ChIL-18和ChIL-18-VP2/4/3,将融合基因片段定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18和pCI-ChIL-18-VP2/4/3;应用PCR法,在本实验室已成功构建的重组真核表达载体pCI-VP2/4/3和pCI-ChIL-18的基础上,构建VP2/4/3基因和ChIL-18基因的共表达载体co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18。在脂质体介导下将上述重组真核表达载体转染Vero细胞,间接免疫荧光证实重组质粒能正常表达目的蛋白,表达的蛋白具有免疫反应性。这为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。     

Analysis of the function of D279N mutation of VP2 of infectious bursal disease virus

Infectious bursal disease virus(IBDV)is responsible for the highly contagious infectious bursal disease of chickens.Further understanding the gene-function is necessary to design the tailored vaccine.The amino acid residue 279,located on strand P_F of VP2,is one of the three residues that have been reported to be involved in cell-tropism but with some inconsistency.In this study,to further clarify the amino acids involved in the cell tropism of IBDV,a series of mutations about residue 279were introduced into the VP2 of vv IBDV Gx strain.With the reverse genetic system,we found single mutation of D279N,double mutations of D279N/A284T or Q253H/D279N were not enough to adapt IBDV to chicken embryo fibroblast(CEF)cell.To evaluate whether residue 279 could influence the replication and virulence of IBDV,the virus r Gx HT-279 with three mutations(Q253H/D279N/A284T)was rescued and evaluated.Results showed that the mutation of residue 279 in VP2had no efficient effects on both the replication efficiency in vitro and the virulence to SPF chickens of IBDV.In summary,the results demonstrated that residue 279 of VP2 did not contribute efficiently to cell tropism,replication efficiency,and virulence of IBDV at least in some strains.These findings provided further information for understanding the gene function of IBDV.     

家蚕表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的免疫原性初步研究(英文)

在家蚕培养细胞及幼蚕中表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）主要宿主保护性抗原VP2蛋白的基础上,初步研究了该表达产物的免疫原性。Western免疫印迹和ELISA均检测到春蚕和秋蚕中的VP2蛋白活性。含VP2的春蚕蚕血制成的注射疫苗皮下注射18日龄非免疫鸡,两周后二免;含VP2的秋蚕蚕血冻干制成口服疫苗,隔天喂服18日龄非免疫鸡。于首免后第10,13,21,28,37日分别采血,第37日攻毒。病毒血清中和试验显示注射组及口服组的中和抗体滴度最高可达1∶4211.3和1∶3118.9,攻毒结果显示它们对IBDV中国标准强毒株BC6/85的攻击保护率为100%和80%。以上研究表明家蚕表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,从而为开发实用化低成本的疫苗打下了扎实基础。IBDV亚单位疫苗的口服免疫有效是一个重要发现。     

传染性法氏囊病病毒的PCR引物设计与Internet检索分析

研究了传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片断的ｃＤＮＡ的结构,并使用ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ引物设计软件,在ＶＰ５和ＶＰ２的重叠基因区设计了一对引物,各种ＩＢＤＶ毒株在此部位有非常高的同源性,在对引物进行Ｉｎｔｅｒｎｅｔ检索中得到了证实。经过对４种ＩＢＤＶ的疫苗标准毒株,１种野毒株,１例病鸡标本试检测,验证引物设计符合要求,具有良好的适应性和较高的灵敏度。