SPF鸡饲料高压蒸汽灭菌条件研究

本试验在121℃条件下,采用不同灭菌时间对不同包装规格的SPF鸡饲料进行高压蒸汽灭菌处理,通过细菌培养和灭菌指示剂对不同处理后饲料的灭菌效果进行检查,以确定饲料最短有效灭菌时间。结果表明,饲料包装尺寸影响高压蒸汽灭菌效果,在包装尺寸合理的前提下,经121℃、20min高压蒸汽处理过的饲料,在30d的保存期内未检测到细菌,可以满足SPF鸡饲料的灭菌要求,生物灭菌指示剂试验得出同样结果。     

兽医实验室高压灭菌技术探讨

本文从兽医实验室高压灭菌规范、使用注意事项和消毒效果验证等方面,对兽医实验室高压灭菌技术进行了探讨。     

高效液相色谱法测定提纯结核菌素效价的研究

为探讨高效液相色谱法测定牛型提纯结核菌素(PPD)效价的可行性,本研究根据PPD中蛋白成分的紫外光吸收波长,采用专用聚苯乙烯/二乙烯苯树脂色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm,300 nm),流动相为乙腈-水-三氟乙酸(25∶75∶0.1),检测波长为271 nm,建立了灵敏、快速的PPD效价的高效液相色谱测定法。在0.4×104 IU/mL～1.1×104 IU/mL的浓度范围内,效价与峰面积呈良好的线性关系,线性回归方程为y=2×106x-6783.6,相关系数R=1.000。将PPD样品用灭菌水稀释后,注入液相色谱仪,测得效价为2.59×104 IU/mg,与传统豚鼠标定法的测定结果(2.91×104 IU/mg)基本一致。该方法简便,灵敏度高,检测速度快,可以较好地控制PPD的质量。     

花粉灭菌技术应用与进展

综述了食品特别是花粉的灭菌技术,并对其原理与应用作了简介.与传统热压灭菌、酒精灭菌等方法相比,辐照灭菌、微波灭菌、高压灭菌等新技术具有灭菌效果好、成分破坏少、无溶剂残留等优点,值得进一步推广.     

牛型提纯结核菌素国家标准品的研制

根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版制备牛型提纯结核菌素(牛PPD)国家标准品候选物4批。根据多糖、核酸和氮含量测定结果,筛选200804批制备为待检国家标准品,其检验结果为:物理性状为乳白色疏松团块,加生理盐水后在5s内溶解;无菌检验合格。200804批准检国家标准品于稀释前各样品变异系数为1.4%,冻干后各样品变异系数为4.8%。效价测定:待检国家标准品4个稀释度引起的豚鼠皮肤红肿面积与国际标准品相对应的稀释度引起的皮肤红肿面积的差值平均值都在10%以内,2者的剂量反应曲线基本平行,即待检国家标准品效价与国际标准品基本相同。200804批待检国家标准品于50℃保存21d之内效价下降程度平均值小于10%,保存28d效价下降程度平均值大于10%。其特异性和安全性均符合要求。     

提纯结核菌素在牛结核病诊断上的初步应用

牛结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性消耗性传染病。通常临床症状不明显。牛结核杆菌主要使牛致病,此外尚能使猪、绵羊及山羊致病,人尤其是儿童常因喝牛奶被感染患肠结核。据报道在城市儿童结核病中由喝牛奶引起的可占30%。据巴斯德研究所的研究人员报道在有的地区结核病人中由牛型分枝杆菌引起的可高达25.9%。结核病不仅严重     

基于二项Logistic回归的多种废弃物同载脉动真空灭菌模式研究

为解决高等级生物安全实验室不同种类废弃物高压蒸汽灭菌处理所需参数不同的问题,本试验采用脉动真空灭菌方法模拟生物安全实验室废弃物处理流程,使用二项Logistic回归算法分析废弃物种类、包装层数、灭菌时间、真空度和脉动真空次数对高压蒸汽灭菌效果的影响。结果显示：废弃物种类、包装层数、真空度和脉动真空次数对灭菌效果均具有显著性影响(P<0.05),而灭菌时间对灭菌效果的影响并不显著(P>0.05);采用3次脉动真空,真空度设定80 kPa,温度维持121℃,灭菌时间30 min可实现对多层包装封口的全种类废弃物有效灭菌。本试验通过探索不同种类废弃物同载灭菌模式,对进一步提升高等级生物安全实验室不同废弃物灭菌处理效率和增强实验室生物安全风险防控能力具有重要技术支撑作用。     

SPF实验动物饲料的灭菌

SPF(Specific pathogen free)实验动物,即无特定病原菌动物。我国现行的《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》和《中华人民共和国兽用生物制品规程》中明确规定:二、三级(SPF级)实验动物须使用灭菌饲料。本文介绍了常用的60Co辐照灭菌、高温高压蒸汽灭菌、微波灭菌,饲料加工     

动物生物安全实验室废弃物分类高压灭菌程序探索

为探索动物生物安全实验室不同种类废弃物合理的高压灭菌程序,探讨脉动真空灭菌器灭菌时间和脉动参数对灭菌效果的影响,以化学指示卡和生物指示剂为判断标准,研究了不同种类废弃物（动物尸体、粪便以及防护服、利器盒等一般废弃物）的灭菌程序。在程序设置方面,以灭菌温度121℃,脉动4次,排空上限80 kPa为灭菌固定参数,通过设置不同的灭菌时间和脉动下限,探索有效灭菌程序。结果显示：当灭菌时间为90 min,排空下限为-10 kPa时,猪、牛、羊等大动物尸体及其粪便灭菌合格;当排空下限为-80 kPa,灭菌时间分别为30、60、120 min时,一般废弃物、小动物尸体、禽类粪便灭菌合格。结果表明,通过调整灭菌时间和脉动参数,对不同种类废弃物进行分类高压,灭菌效果更加理想。本研究为动物生物安全实验室的废弃物处理提供了参考。     

禽结核菌素生产用菌种的制备与鉴定

为制备禽结核菌素国家标准品,研究禽结核菌素生产用菌株禽分枝杆菌的菌种特性,对1992年冻干保存的3株菌CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203进行复苏,采用SPF鸡复壮,分离培养后冻干了新批次菌种,对菌种形态、生化特性、培养特性、毒力和抗原性进行了鉴定。结果表明,制备的菌种纯粹,形态、生化和培养特性符合禽分枝杆菌的生物学特征,免疫原性符合的兽用生物制品质量标准的规定。本研究为禽分枝杆菌的鉴定提供参考,也为制造禽结核菌素的工艺改进奠定基础。     

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。     

检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用

纽布病毒(nebovirus, NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×10~1～2.9×10~9copies·μL^-1之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^2=0.999 4,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29 copies·μL^-1;批内和批间的变异系数分别为0.89%～1.89%和0.83%～1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P<0.05)。对2018年8—11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。     

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒（BNoV）是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶（RdRp）基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×10²~2.24×10⁸拷贝·μL^-1线性关系良好,相关系数R²=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL^-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月-2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%（25/221）,采样场阳性率为92.86%（13/14）。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)基因序列,利用在线软件Primer Explorer V4 Software和Primer Premier 5.0,针对BPIV-3 NP基因序列的保守区设计并筛选了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP) 引物,建立BPIV-3特异性检测的RT-LAMP方法。在Bst DNA聚合酶作用下,63 ℃恒温反应1 h即可完成扩增过程,扩增产物通过浑浊度比较、凝胶电泳和肉眼可视化进行判定。结果表明,该方法比RT-PCR敏感度更高,最低检出量可达0.069 fg/μL。该方法可用于牛副流感病毒3型的实验室检测和临床初步诊断。     

检测牛5种腹泻病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

牛A群轮状病毒(BRVA)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺瓦病毒(BNoV)和牛纽布病毒(BNeV)是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况.本试验的目的 是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法.通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、...     

Establishment of an ELISA for Measuring Bovine Pregnancy-Associated Glycoprotein in Serum or Milk and Its Application for Early Pregnancy Detection

It has been shown in several mammalian species that during pregnancy, trophoblast cells express a range of pregnancy-associated glycoproteins (PAG). The presence of PAG in the maternal serum of cows may serve as an indicator of pregnancy from day 28 after AI onward. The present study addresses (1) conversion of an existing PAG-RIA to a competitive double antibody ELISA using a polyclonal anti-bPAG-IgG and an anti-rabbit-IgG raised in sheep for coating and (2) application of newly established ELISA to test its suitability for pregnancy detection by measuring PAG in serum or milk. The intraassay coefficients of variation (CV) for the PAG-ELISA were 2–14% for serum and 10–12% for milk; the corresponding interassay CVs were 8–22% and 12–22%, respectively. Pregnancy-associated glycoprotein profiles established in milk and serum of 12 pregnant cows showed a characteristic pattern with measurable amounts from approximately day 20 onwards in serum and from day 60 onwards in milk. In a field trial, serum PAG was determined in 397 cows sampled between 20 and 50 days after insemination. The outcome was that, pregnancy could reliably be diagnosed from day 28 onwards in serum and from day 150 onwards in milk. In conclusion, it may be stated that the established ELISA provides an efficient and reliable means of pregnancy diagnosis that will, in our judgement, gain in popularity with cattle breeding. The ELISA proved to be an adequate and efficient way of measuring PAG in maternal serum or milk and will be a useful means of pregnancy detection in cows.     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示：该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10⁴和10³ copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%...     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出471 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10^-1 TCID₅₀/mL。应用该方法对临床腹泻病牛各脏器样品进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

牛副结核病PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因序列设计特异性引物,对牛副结核分枝杆菌进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为246 bp,与预期扩增序列同源性为99.6%。该PCR检测体系的特异性强,不能在非副结核分枝杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为1 pg。该检测体系的成功构建为牛副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。