鸡白痢沙门菌外膜蛋白C的原核表达与免疫反应性分析

利用PCR方法扩增鸡白痢沙门菌主要抗原外膜蛋白C的基因,将其定向克隆至pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,利用His标签的蛋白纯化柱纯化重组蛋白,通过免疫印迹检测重组蛋白活性。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定获得了pET30a-C原核表达重组质粒,转化BL21表达菌后,通过IPTG诱导获得以包涵体形式存在的重组蛋白,重组蛋白纯化后免疫印迹检测显示具有良好的反应原性。本研究为鸡白痢基因工程抗原的制备及诊断试剂研究奠定了基础。     

鸡肠炎沙门氏菌外膜蛋白F的原核表达及免疫原性分析

根据GenBank中收录的鸡肠炎沙门氏菌OmpF基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌辽宁分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌OmpF基因,用IEDB Analysis Resource在线预测分析,该基因可能存在15个线性B细胞抗原表位;同时将该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-OmpF,转入大肠杆菌BL21中,获得OmpF重组蛋白。Western-blot检测结果表明,该重组蛋白的分子质量约为66 kD(含标签蛋白),能被鸡沙门氏菌阳性血清识别,初步证实该蛋白具有免疫原性,为鸡肠炎沙门氏菌亚单位疫苗的进一步研究和开发奠定了理论基础。     

布氏杆菌外膜蛋白OMP15的原核表达及免疫原性测定

对布氏杆菌病的诊断,在我国目前仍然沿用传统方法[1].这些方法主要检测的目标是菌体胞壁上整个脂多糖产生的抗体,因布氏杆菌与其他细菌的LPS结构相似[2],诊断检疫过程中难免存在假阳性,出现错判和误判的问题,常常给政府兽医执法机关带来尴尬的局面.     

坏死梭杆菌120ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了揭示坏死梭杆菌(F.necrophorum)120ku血凝素相关外膜蛋白的免疫原性,根据F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白基因的抗原表位分布情况设计特异性引物,扩增出3个彼此重叠、覆盖整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3,分别构建重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3,在大肠杆菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting分析重组蛋白的表达情况和反应原性;以纯化的重组蛋白为抗原免疫试验兔,分析重组蛋白的免疫原性。结果显示,重组蛋白P1、P2、P3在大肠杆菌中均得到表达,分子质量分别约为48、59、62ku,能与F.necrophorum阳性的小鼠血清反应,可以刺激试验兔产生特异性抗体,说明F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白具有良好的免疫原性,为F.necrophorum基因工程亚单位疫苗的研制提供参考依据。     

胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白的原核表达及免疫原性分析

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型SC-A株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜脂蛋白(OML)基因特异片段,并克隆于pMD18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pET-32 a(+),成功构建了重组表达载体pET-mOML。以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白(TRX-mOML)分子质量约为60 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,采取非变性电泳方法对蛋白进行纯化,经ELISA检测,重组OML免疫小鼠可产生较高水平的抗OML抗体,这表明重组OML有较好的免疫原性。     

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

【目的】探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。【方法】构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。【结果】重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和...     

鸡白痢沙门氏茵外膜蛋白C基因（OmpC）的克隆与表达

以鸡白痢沙门氏菌基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到1 026 bp的OmpC基因片段.将扩增的OmpC基因克隆至大肠杆茵-乳酸茵穿梭表达载体pW425et中,构建原核表达重组质粒pW425et-OmpC.将pW425et-OmpC转化至 thyA基因缺陷型大肠杆茵感受态E.coli X13中.SDS-PAGE分析可见1条约36 ku的融合蛋白.Western blot分析表明,该重组蛋白具有反应原性,本研究结果为pW425et-OmpC在乳酸茵中的表达提供了实验依据.     

迟缓爱德华菌外膜蛋白FadL原核表达及免疫原性

FadL是革兰阴性细菌编码的外膜通道蛋白,参与长链脂肪酸的转运,沙门菌中该蛋白作为免疫原使用具有优良的保护效果。本试验以迟缓爱德华菌FadL蛋白作为研究对象,原核表达并纯化该蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白的免疫特性和免疫效果。结果显示,成功表达和纯化重组FadL蛋白(rFadL),蛋白大小为50 000。小鼠试验结果表明,rFadL免疫小鼠能产生高水平特异性抗体;斑马鱼感染试验结果表明,rFadL能够对斑马鱼迟缓爱德华菌产生一定免疫保护力,保护率可达55%。本试验揭示了迟缓爱德华菌FadL蛋白的免疫特性,为迟缓爱德华菌疫苗研发提供了参考和借鉴。     

坏死梭杆菌外膜蛋白提取及免疫原性分析

从坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,FN)中提取外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)并分析免疫原性。采用无菌心脑浸液(BHI)肉汤培养基培养坏死梭杆菌,用20mmol/L HEPEs-LiCl缓冲液提取外膜蛋白,经SDS-PAGE、Western blot和接种小鼠病理学检测分析表明,具有唯一条带,分子质量为44.5ku,具有良好的免疫活性并有一定毒性,研究结果为坏死梭杆菌亚单位疫苗研制奠定了基础。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC原核表达及其免疫原性

TolC是革兰阴性细菌一种外膜通道蛋白,参与细菌应对外界不利环境的耐受,沙门菌TolC蛋白作为免疫原对动物沙门菌感染的保护效果优良,具有潜在的应用价值。目前,迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)该蛋白的研究尚未见有报道,本研究以E.tarda TolC蛋白作为研究对象,原核表达并纯化TolC蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白具有较强的免疫原性,免疫动物对致病性E.tarda ET-13强毒株感染具有较高的抵抗力。结果表明,E.tarda TolC蛋白具有较强的免疫原性和潜在的疫苗价值,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供理论资料。     

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析

将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

副猪嗜血杆菌Plp4蛋白的原核表达及免疫原性分析

为原核表达副猪嗜血杆菌P1p4蛋白,本研究通过PCR方法扩增P1p4全长基因并克隆于pET-28a(+)载体中,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态中,采用0.4 mM IPTG经22℃诱导表达了35 ku的重组蛋白.经western blot试验证明Plp4蛋白具有良好的反应原性,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA检测表明制备的抗血清效价在1∶15000以上,表明P1p4蛋白具有良好的免疫原性.     

鸡白痢沙门杆菌的分离鉴定及药敏试验

鸡白痢沙门杆菌为肠道杆菌科沙门杆菌属成员之一,主要侵害各种年龄的鸡和火鸡,7～14日龄雏鸡的发病率、死亡率最高.我国目前控制鸡白痢的主要措施是检疫淘汰带菌鸡,净化培育无白痢鸡群,一些没有条件净化的鸡群则采用抗菌药物进行预防和治疗,但抗菌药物使用不当或滥用不但达不到控制该病的目的,还常常导致药物残留和耐药菌株的出现.     

白痢沙门菌CpxR的生物信息学分析和原核表达

对白痢沙门菌二元调控系统响应蛋白CpxR进行生物信息学分析,提示CpxR可能发挥了重要的生理功能。同时,构建了重组表达载体pET32a-CpxR,转化表达菌株BL21后,对其进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot结果表明CpxR获得了正确表达。纯化蛋白免疫小鼠制备了多抗血清,Western blot验证其有一定的免疫原性。为深入研究其生理功能和调控机制奠定了理论基础。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白的免疫原性

对来自江西、广东、上海三省市的82个副猪嗜血杆菌野外分离株进行SDS-PAGE分析,采用强毒力野外分离株的多克隆抗血清,通过Western blotting对副猪嗜血杆菌OMP和全细胞蛋白的免疫原性进行研究,寻找具有共同抗原决定簇的免疫原性蛋白.结果表明免疫血清对不同来源的分离株具有良好的交叉免疫反应,患病猪的分离株OMP和全细胞蛋白具有较强的免疫原性,健康猪的分离株OMP免疫原性较全细胞蛋白免疫原性弱.不同菌株的共同免疫原性蛋白为OMP中相对分子质量为37 000～40 000、28 000～30 000的蛋白.     

EDTA对鸭疫里氏杆菌外膜蛋白表达及免疫原性的影响

用加入金属离子螯合剂EDTA的TSB(胰酪胨大豆肉汤)培养基,培养鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)Ⅰ型,将未加入EDTA的TSB培养的RAⅠ型菌株作对照。比较后发现,加入EDTA组的外膜蛋白(OMPs)的SDS-PAGE图谱发生改变,从34 ku~100 ku增加了多条蛋白条带,特别是39 ku,60 ku和110 ku蛋白浓度较大。电泳胶经Western-blot(康复血清作为一抗,自制酶标兔抗鸭为二抗),与对照组相比,实验组增加了39 ku条带。实验证明,加入金属离子螯合剂EDTA对外膜蛋白的表达和免疫原性均有影响。     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5基因的表达及表达产物的免疫原性分析

实验通过将副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)P5基因克隆至pET-28a(+)中,构建pET-OMP5原核表达质粒,再将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),通过IPTG诱导重组菌,SDS-PAGE显示pET-OMP5重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,Western-blot表明融合蛋白能被阳性血清识别。昆明小鼠试验结果表明OMP5重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。     

鸭疫里氏杆菌外膜蛋白免疫原性研究

本研究采用超速离心法提取鸭疫里氏杆菌的外膜蛋白,在电镜下呈典型的双层泡状结构,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结果细菌的外膜蛋白的分子量在２１ＫＤ和１５１ＫＤ之间。经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,４４ＫＤ外膜蛋白与免疫鸭血清和自然感染后康复鸭血清出现较强的阳性反应,而感染发病的濒死鸭血清反应则很微弱。