鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。     

LacS基因原核表达载体构建及重组蛋白表达

克隆得到硫矿硫化叶菌中的糖苷酶基因LacS,利用原核表达载体pASK-IBA-2构建重组质粒pASK-IBA-2-LacS,酶切和测序鉴定证实LacS基因成功插入且基因阅读框正确。重组质粒pASK-IBA-2-LacS转化大肠杆菌Rosseta,去水四环素诱导后,菌液裂解离心亲和层析获得重组蛋白,western blot证实LacS在大肠杆菌Rosseta能高效表达。     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

重组奶牛神经肽Y基因的原核表达载体的构建、表达及纯化

<正>在奶牛的饲养过程中,由于高产品种的引进、培育,高能饲料的开发、利用,规模化饲养程度的提高等众多方面的原因,使得酮病和脂肪肝的发病率长期以来一直居高不下。我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的15%～30%,脂肪肝的发病率超过30%,又     

鸡干扰素-α基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素（IFN）-α因其具有很强的抗病毒活性而备受关注。本研究根据GenBank上公布的鸡IFN-α核酸序列设计1对引物,用PCR方法扩增出鸡IFN-α基因,并将其克隆到原核表达载体pET-32a及pET-30a-DsbA上,得到重组质粒pET-32a-IFN-α及pET-30a-DsbA-IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析,结果表明pET-30a-DsbA-IFN-α表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约40.4 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,且表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

鸡β－防御素－2基因的克隆及原核表达载体的构建

鸡β－防御素是一类广谱抗茵阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal－2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT—PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM—TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM—T—Gal－2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL—c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL—c2x—Gal－2重组质粒。     

鸡β-防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

鸡β-防御素是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal-2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM-TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM-T-Gal-2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL-c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL-c2x-Gal-2重组质粒。     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达

对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒，进行EcoR Ⅰ和Sα／Ⅰ双酶切，获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。提取质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确，从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，证明其分子质量约为29ku；Western-blotting分析表明，该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别，具有生物学活性。     

奶牛溶菌酶基因原核表达载体的构建

为了构建奶牛溶菌酶(lysozyme,LYZ)原核表达载体,试验人工设计并合成LYZ基因CDS序列,将其克隆至表达载体p ET32T,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定。结果表明:PCR扩增和双酶切产物的分子质量分别为1 000 bp和400 bp,与预期大小一致;扩增产物经测序鉴定,也与目的片段完全一致。说明原核表达载体LYZp ET32T构建成功。     

重组奶牛干扰素-α基因的原核表达

从健康奶牛的血液中分离白细胞，用刺激物诱导白细胞产生干扰素，采用RT—PCR扩增干扰素-α基因，构建原核表达载体pQE30-IFNα，用IPTG诱导表达。得到重组的奶牛成熟干扰素-α基因全长498bp，构建的原核表达载体诱导6h后表达量较高，表达产物的分子量约为20kD，从而获得了表达奶牛干扰素-α的基因工程菌株。     

哈萨克羊抑制素α基因原核表达载体的构建及其诱导表达

本实验以新疆哈萨克羊睾丸组织为实验材料,提取组织总RNA,经反转录得到c DNA并以此为模板,用以Gen Bank(NM_001308579.1)序列为参考设计的特异性引物进行PCR扩增,之后将扩增产物与p ET32a(+)载体相连,构建重组质粒p ET32a(+)-INHα。将构建好的重组质粒转化到受体菌E.coli BL21中,经IPTG诱导,表达p ET32a(+)-INHα重组蛋白。对扩增产物的测序鉴定结果显示INHα基因克隆成功;经过酶切和测序鉴定确定准确构建了p ET32a(+)-INHα重组载体;经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,检测到INHα基因编码区全序列表达的重组蛋白单一条带,这说明原核表达载体构建成功并在原核细胞中正常表达,这为今后绵羊INHα基因的免疫功能研究提供了参考依据。     

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。     

牛分支杆菌αg85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b.     

鸡去泛素化相关因子1基因原核表达载体的构建及表达

构建鸡去泛素化相关因子1(Chicken ubiquitin-related factor 1,chUAF1)的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定.将提取的鸡法氏囊cDNA根据哺乳动物基因组的特性5'-端GC含量高3'-端GC含量低的特点设计2对引物,PCR获取2段基因片段.将两者用搭桥部分的酶切位点进行酶切,胶回收,连接成chUAF1基因全长,再将基因克隆入pMD18-T载体,酶切鉴定后,将chUAF1基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UAF1.转化BL21(DE3)大肠杆菌中,IPTG诱导表达并鉴定.结果显示,所构建的chUAF1基因表达载体pET28a-chUAF1经PCR及DNA测序结果表明构建正确,SDS-PAGE鉴定在预期位置出现阳性条带.结果表明,已成功构建了pET28a-chUAF1原核表达载体,为下一步试验提供了依据.     

鸡白介素18基因原核表达质粒构建

根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1 8的生物学特性及其临床应用打下了基础     

水牛ghrelin基因原核表达载体构建与蛋白表达

为了研究水牛ghrelin基因的结构与功能,本试验对水牛ghrelin基因进行原核表达载体构建与融合蛋白表达条件的优化。采用RT-PCR方法从水牛胃组织的总RNA中扩增出ghrelin编码区,连接到pRSET-a载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆子,用IPTG进行诱导表达条件的优化。结果表明,成功构建原核表达载体pRSET-a-ghrelin,在2 mmol/L IPTG,37℃的条件下诱导表达4 h,水牛ghrelin重组蛋白可成功获得表达,经SDS-PAGE鉴定发现,ghrelin融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 ku,其表达量占总菌体蛋白量的35%。本试验结果为进一步研究水牛ghrelin基因的结构和功能提供有价值的生物学信息。     

猪β2m四聚体前体链重组表达载体的构建和表达

为构建猪β2m轻链四聚体前体链,通过PCR定点突变技术,将猪主要组织相容性复合体Ⅰ类分子轻链β2m羧基端69位苯丙氨酸(Phe)突变为半胱氨酸(Cys),然后将突变体基因插入到pET-28a载体,转化BL21细胞,经诱导后SDS-PAGE检测蛋白质表达情况。结果显示,β2m突变体基因全长297 bp,编码98个氨基酸,其中羧基端69位Phe突变为Cys。突变体基因经诱导表达后进行SDS-PAGE检测,结果显示蛋白质表达大小为10.6 ku。本研究构建了猪β2m轻链突变体基因重组表达载体,并成功表达了目的蛋白,为今后构建四聚体链奠定基础。