马铃薯R2R3-MYB转录因子的克隆及植物表达载体的构建

MYB转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,广泛参与植物初生和次生代谢调控、细胞形态的建成、环境胁迫的应答等。前期转录组测序表明抗晚疫病的马铃薯材料加湘1号接种晚疫病菌后其MYB基因家族中的一个R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243的表达量显著上调。为了探讨R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243在马铃薯晚疫病抗病过程中发挥的作用。本研究通过PCR扩增了加湘1号中的该基因,并通过XcmⅠ酶切、连接将其装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-JX-R2R3,并转化到农杆菌GV3101中。该研究为R2R3-MYB转录因子的基因转化及后续的功能分析提供了理论指导。     

基于RNA-Seq的彩色马铃薯MYB转录因子家族分析

植物MYB转录因子是功能多样、数量众多的转录因子之一,对植物的生长发育和代谢调控起着极其重要的作用.本研究基于彩色马铃薯块茎转录组测序数据,对彩色马铃薯发育过程中MYB转录因子基因进行筛选,并对其保守结构域、亚细胞定位进行分析;同时利用TMEV软件对其中R2R3-MYB转录因子的差异表达进行分析,并对差异显著的R2R3-MYB转录因子进行功能预测.结果 表明,基于转录组测序数据,筛选得到143个彩色马铃薯MYB类转录因子基因,根据结构特征分为4大类:1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB;亚细胞定位结果显示,138个MYB转录因子定位于细胞核,4个定位于细胞膜,1个定位细胞质;保守域分析显示,R2R3-MYB类转录因子的保守基序为R2、R3;彩色马铃薯R2R3-MYB转录因子基因在不同时期差异表达,其中上调表达10个、下调表达5个;根据GO富集性分析,共注释到6个和花青素相关的R2R3-MYB转录因子,本研究为下一步彩色马铃薯花青素合成相关MYB基因生物学功能和代谢调控机制的研究提供参考.     

基于RNA-Seq的彩色马铃薯MYB转录因子家族分析

植物MYB转录因子是功能多样、数量众多的转录因子之一,对植物的生长发育和代谢调控起着极其重要的作用.本研究基于彩色马铃薯块茎转录组测序数据,对彩色马铃薯发育过程中MYB转录因子基因进行筛选,并对其保守结构域、亚细胞定位进行分析;同时利用TMEV软件对其中R2R3-MYB转录因子的差异表达进行分析,并对差异显著的R2R3-MYB转录因子进行功能预测.结果 表明,基于转录组测序数据,筛选得到143个彩色马铃薯MYB类转录因子基因,根据结构特征分为4大类:1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB;亚细胞定位结果显示,138个MYB转录因子定位于细胞核,4个定位于细胞膜,1个定位细胞质;保守域分析显示,R2R3-MYB类转录因子的保守基序为R2、R3;彩色马铃薯R2R3-MYB转录因子基因在不同时期差异表达,其中上调表达10个、下调表达5个;根据GO富集性分析,共注释到6个和花青素相关的R2R3-MYB转录因子,本研究为下一步彩色马铃薯花青素合成相关MYB基因生物学功能和代谢调控机制的研究提供参考.     

陆地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

【目的】克隆了1个在棉纤维发育次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子基因Gh MYB52(Gh_A12G2460)。本研究旨在分析该MYB转录因子在陆地棉纤维次生壁发育过程中的作用。【方法】通过一步克隆法,从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆了1个在纤维次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB转录因子基因Gh_A12G2460,进化树分析结果表明Gh_A12G2460与拟南芥中AtMYB52基因的相似度最高,因此将其命名为Gh MYB52。通过进化树构建、氨基酸序列多重比对、定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、烟草瞬时转化、酵母双杂交等对其基因结构、编码产物的结构、表达特征、亚细胞定位以及互作蛋白进行了分析。【结果】GhMYB52基因的开放阅读框长672 bp,编码223个氨基酸残基,预测蛋白的相对分子质量为26.06 kDa,等电点为9.83。qRT-PCR结果表明,Gh MYB52基因在开花后15～25 d的棉纤维中优势表达。亚细胞定位结果显示,GhMYB52蛋白定位于细胞核,符合转录因子的特征。酵母转化结果显示,GhMYB52蛋白具有强烈的转录激活活性,并且与1个NAC类转录因子GhFSN1有强烈互作。【结论】GhMYB52是1个在棉花纤维次生壁加厚时期优势表达的R2R3类MYB转录因子,它可能通过与NAC类转录因子互作,形成蛋白复合物参与棉花纤维次生壁加厚过程。本研究为进一步从分子水平上验证GhMYB52基因在棉花纤维发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

陆地棉GhMYB4基因沉默载体构建及转基因棉花的鉴定

MYB转录因子是植物中最大的转录家族之一,广泛参与植物逆境胁迫应答、生长发育及细胞形态的建成等生理活动。为了研究GhMYB4基因在棉花中的生物学功能,本研究利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRMYB4前体的植物表达载体amiRGhMYB4-pCAMBIA3301,通过农杆菌介导喷花法转化棉花植株。Bar基因PCR检测获得19株阳性植株,319-3301引物PCR检测获得16株阳性植株,3301通用引物PCR检测获得7株阳性植株,综合3组引物检测结果共获得7株阳性植株,以上结果表明,已获得GhMYB4转基因棉花。本研究结果为进一步研究陆地棉GhMYB4基因棉花纤维发育机制提供材料基础。     

NDPK1在细胞分裂中的功能分析

为明确NDPK1在细胞分裂过程中的作用及作用机制,本研究利用过表达技术,分析过表达NDPK1转基因拟南芥的株高和茎粗;用扫描显微镜观察比较过表达NDPK1转基因拟南芥细胞大小和形态、统计单位面积中细胞数目;利用RT-PCR技术,检测过表达NDPK1转基因拟南芥中细胞分裂相关基因的表达情况,初步分析NDPK1对细胞周期的调控机理。结果表明:过表达NDPK1转基因拟南芥下胚轴长度高于Col-0野生型拟南芥;过表达NDPK1转基因拟南芥的下胚轴细胞数目多于Col-0野生型拟南芥;过表达NDPK1中细胞分裂的促进因子CDC2和CycD2的表达量明显高于Col-0野生型拟南芥。以上结果表明,NDPK1可通过调控CDC2和CycD2的表达进而促进细胞分裂。     

SmPAP1基因特异性沉默导致转基因丹参体内的酚酸含量显著下降

R2R3-MYB类转录因子在植物次生代谢中具有十分重要的调控作用。丹参SmPAP1是一个R2R3-MYB类转录因子基因。为了探讨SmPAP1是否参与丹参酚酸类化合物生物合成的调控,本研究以拟南芥miRNA319前体为基本骨架,通过over-lapping PCR技术构建artifical miRNA(amiRNA)植物表达载体进而对SmPAP1进行特异性沉默。Real-time PCR和杂交结果显示:与对照株相比,阳性转基因株系中SmPAP1的mRNA水平均呈现不同程度的显著下降,同时酚酸类化合物合成途径中酶基因也呈现不同程度的显著下调;总酚含量测定结果显示:转化株系中总酚酸含量均约为同期野生型丹参的50%。研究结果说明SmPAP1可能作为一个重要的转录因子参与丹参酚酸类活性物质的代谢调控。     

转录因子BcWRKY22在低温促进菜心抽薹开花中的功能分析

WRKY类转录因子参与植物生长发育调控及低温逆境应答。然而低温条件下WRKY参与菜心提前抽薹开花的分子机制尚不明确。本研究采用15℃低温处理菜心幼苗24 h、48 h,结果表明低温能使菜心叶片和茎尖中BcSOC1基因的表达量升高,菜心提前抽薹开花。低温处理对菜心茎尖和叶片中13个WRKY转录因子基因表达都有不同程度的影响,菜心BcWRKY22基因受低温上调表达。在拟南芥中异源表达菜心BcWRKY22基因可以使拟南芥提前抽薹开花,转基因植株叶片中AtSOC1的表达量显著高于野生型。酵母单杂交实验表明BcWRKY22转录因子可以结合BcSOC1基因的启动子。本试验说明BcWRKY22转录因子响应低温胁迫,可能通过对开花相关基因BcSOC1的启动子直接结合作用来调控菜心提前开花。     

甘薯基因组R2R3-MYB转录因子鉴定与分析

MYB是植物中数量众多且功能重要的转录因子家族.本研究通过生物信息学方法从未经注释的甘薯全基因组序列中筛选鉴定出MYB家族基因,分析了R2R3-MYB类基因的结构与功能.结果 发现,甘薯基因组中含有R2R3-MYB转录因子基因88个,均含有完整的R2、R3保守结构域,且R2、R3保守结构域中分别含有8个和9个高度保守的碱性氨基酸.MEME分析结果表明,甘薯R2R3-MYB蛋白序列中含有10个保守基序,其中80％以上的R2R3-MYB序列中含有motif 1、motif2、motif3、motif4、motif5以及motif7;利用circos软件定位R2R3-MYB序列在染色体上的分布情况,发现甘薯88个R2R3-MYB基因不均匀分布在15条染色体上,其中5号染色体上数量最多,达15个,4号和13号数量最少,仅2个,经序列比对分析,发现它们在染色体内和染色体间均存在复制关系,其中存在于染色体间潜在复制关系的基因有6对,染色体内有20对,且这20个基因对中有19对在染色体上成簇状分布.经序列功能预测与归类,有44个R2R3-MYB转录因子基因可归入拟南芥R2R3-MYB基因分类的13个亚组中,分别参与响应生物与非生物胁迫、花青素合成、花药发育等途径.进一步分析发现,甘薯中有36个R2R3-MYB转录因子基因可能在响应生物和非生物胁迫上发挥重要功能,其中9个基因在尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.batatas,Fob)胁迫下表达量出现明显上调/下调变化,27个在低温胁迫下表达量出现明显上调/下调变化.甘薯R2R3-MYB转录因子结构域高度保守,R2和R3结构域中均含有较高的保守基序;进化树及转录组测序分析显示部分基因可能参与植物生长发育、代谢调控以及生物与非生物胁迫等途径,可为甘薯抗性育种提供参考.     

野生大豆碳酸盐胁迫应答基因GsMIPS2的克隆及功能分析

为挖掘野生大豆(Glycine soja L.G07256)耐碳酸盐关键功能基因,利用前期高通量转录组测序数据,从构建的碳酸盐胁迫基因表达谱中,选取了一个碳酸盐胁迫下显著上调表达的肌醇-1-磷酸合酶类基因。采用同源克隆的方法,获得该基因的全长cDNA,命名为GsMIPS2。实时荧光定量PCR结果显示该基因受碳酸盐胁迫诱导表达,并且其表达量具有组织特异性。将GsMIPS2基因转化拟南芥,并结合拟南芥中T-DNA插入突变体atmips2来验证其耐碳酸盐功能。结果表明,碳酸盐胁迫条件下,GsMIPS2超量表达拟南芥种子萌发率显著高于野生型,而拟南芥突变体atmips2种子萌发率显著低于野生型。上述结果表明,GsMIPS2基因在植物应答碳酸盐胁迫过程中起重要作用。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

棉纤维发育相关转录因子的研究进展

 转录因子在棉纤维细胞分化发育过程中起重要的调节作用。近年来已经有多个与棉纤维发育相关的转录因子被研究报道,主要包括MYB、HD-ZIP、MADS、TCP等家族成员,其中研究最为广泛的为MYB类转录因子。GL1类的MYB转录因子和MIXTA类的MYB转录因子通过不同的调控方式参与对棉纤维细胞发育的调控。对这些转录因子的深入研究,对于揭示棉纤维细胞分化发育的分子机理具有重要的意义。本文就这方面的研究进展作一简要概述。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

蒺藜苜蓿转录因子MtMYB的克隆、表达分析及拟南芥转化

MYB转录因子家族基因具有保守的DNA结合域,是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的代谢调控,在植物生长发育和胁迫响应等方面发挥重要作用。为改良品种性状和提高生产实践能力,本研究采用RT-PCR法克隆蒺藜苜蓿MYB转录因子基因MtMYB,其编码区长255 bp,编码84个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白与其他物种MYB蛋白具有很高的同源性,其中与红三叶同源性最高。荧光定量结果表明,MtMYB基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。MtMYB基因在外源IAA、6-BA的诱导下,总体都呈现先上升后下降的趋势。同时本研究成功构建35S::MtMYB的植物表达载体,并通过转基因技术将其转化至拟南芥中,PCR检测表明,MtMYB已成功整合至转基因拟南芥基因组中。RT-PCR检测表明,MtMYB能够在转基因拟南芥中正常转录。本研究为进一步探明MtMYB基因的功能提供了数据参考和实验材料。     

小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析

TaPIM1是从小麦中克隆获得的1个病原诱导的小麦MYB基因,编码由323个氨基酸残基组成的蛋白TaPIM1。TaPIM1具有R2R3类MYB转录因子的典型结构,即2个保守的MYBDNA结合域(R2和R3)、核定位位点和酸性激活区。TaPIM1的全长氨基酸序列与已克隆MYB蛋白的一致性仅为43.69%以下,为植物MYB转录因子家族R2R3亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中TaPIM1基因的上调表达,说明TaPIM1可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将TaPIM1基因构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38品系。通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,鉴定出转TaPIM1基因烟草T0代株系M66、M102、M110等12个株系。对转基因烟草T1代株系进行PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析,结果表明,TaPIM1超量表达的转基因烟草株系M66、M102和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照,TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌的防御反应。     

大豆转录因子GmMYB52的克隆、表达及结合功能分析

MYB类转录因子在植物的生长发育和逆境响应中有重要的调控作用。依据课题组前期获得的盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据,获得盐胁迫响应显著上调基因GmMYB52,利用RT-PCR方法从栽培大豆(Williams 82)中克隆该基因片段,并与已公布的Williams 82基因组数据库序列比对,该基因与GmMYB52序列一致。生物信息学分析表明,GmMYB52编码区(CDS)全长1083 bp,编码360个氨基酸。其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其距N端110~160氨基酸残基处有MYB结构域;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与GmMYB62、拟南芥AtMYBSt1、苜蓿Mt MYB52、水稻Os MYBS3及木豆Cc MYB-like protein J的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明,大豆根部GmMYB52的转录水平受外界非生物逆境的调控,用脱落酸(ABA)和低温(4℃)处理后12 h明显上调,用氯化钠和PEG处理0.5~24.0 h后检测到GmMYB52的转录水平在50%~600%区间内呈现出先上调后下调再上调的趋势。GmMYB52为组成型表达,在大豆的幼苗期和开花期表达较多,在成熟期表达相对较低。GmMYB52在茎叶与开花期的花中表达较强,在根的表达较弱,而在成熟期的豆荚中几乎不表达。亚细胞定位的结果表明,GmMYB52定位于细胞核,符合典型转录因子的定位特征。酵母杂交系统检测表明,GmMYB52具有转录激活特征,并且能够与MYB相关顺式作用元件基序相结合。本研究结果表明,GmMYB52编码典型的MYB转录因子,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能参与了大豆对非生物胁迫的响应。     

海岛棉转录因子基因GbMYB60的克隆、表达及其抗逆性分析

MYB转录因子是在真核生物细胞内广泛存在的一类转录因子蛋白,在植物的生长发育、代谢调节、抗病抗逆、以及激素介导的信号路径等方面都发挥着重要的作用。本研究从海岛棉品种海7124中克隆得到一个MYB转录因子基因,根据序列同源性和进化分析,将其命名为GbMYB60。该基因序列长990 bp,编码一个36.9 kD的R2R3类MYB转录因子蛋白。GbMYB60蛋白被特异地定位于植物细胞核。GbMYB60基因的表达水平较低,在真叶中优势表达,根系中表达量最低。该基因受甘露醇、NaCl、低温、高温等非生物逆境,以及脱落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸等植物激素的诱导上调表达。利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中干涉GbMYB60发现,降低GbMYB60基因的表达水平,使棉花幼苗对高盐胁迫的耐受性降低;但GbMYB60干涉的植株在甘露醇溶液的处理下与对照植株并无显著的抗性差异。