一种磺脲型除草剂一苯磺隆诱导甘蓝型油菜雄性不育的研究

油菜的籽粒产量和其它农艺性状存在显著的杂种优势。胞质雄性不育（CMS）和核雄性不育（NMS）在油菜中都得到了广泛的应用。然而有些CMS系统的保持系和恢复系存在不稳定性。NMS系统在制种时需要人工去除母本50％的可育株。此外，建立CMS和NMS系统还非常费时。利用化学杂交剂（CHA）为我们提供了一种快速、灵活和有效的利用杂种优势的体系。     

化学杂交剂EXP对油菜的杀雄效果

化学杂交剂EXP的主要成分是一种磺酰脲类化合物,作用靶标是植物的乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase,ALS）,通过抑制酶活性,阻止支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成。在甘蓝型油菜自交系82089抽薹15～20 cm高,最大花蕾长度1～2 mm时期,单株用药量12～15 mL,用0.05 μg/mL、0.25 μg/mL EXP溶液处理可分别诱发92%和97%不育率。而0.25 μg/mL浓度处理不育株的育性较为稳定,自交结实率为6.6%,可以作为最佳用药浓度的参考值。EXP透导的不育株叶色变浅、株高降低、花蕾密集、花期推迟、花瓣褪色、花药干瘪无花粉。检测结果表明,不育株花蕾叶绿素和类胡萝卜素含量有所减少,处理雄蕊的过氧化物酶和酯酶活性降低,而水溶性蛋白质含量显著减少。同一时期用EXP处理芥菜型油菜和白菜型油菜也可诱导雄性不育,但芥菜型油菜不育持续时段较短,白菜型油菜结实性不好,不宜用于生产杂交种。本研究结果的意义在于,磺酰脲类ALS抑制剂种类非常多,有可能从中筛选到更高效、更持久的化学杂交剂。     

化学杂交剂诱导油菜雄性不育机理的研究：I.杀雄剂1号对甘蓝型油菜…

研究揭示了甘蓝型油菜花药壁发育类型属双子叶型，毡绒层为同型单起源毡绒层，又可称为分泌型腺毡绒层。用０．０３％杀雄剂１号处理９个不同发育时期的甘蓝型油菜，研究其诱导雄性不育的效果，结果表明：造胞细胞时期以前处理都是无效的，花粉母细胞以后处理才有效，尤以单核期处理效果最好，不育株率接近１００％。这是由于杀雄剂１号诱导甘蓝型油菜花药毡绒层偏离了正常的发育方式，而形成异常的毡绒层，表现为毡绒层增厚，提早解     

抗磺酰脲类除草剂基因用于转基因油菜筛选标记

本研究克隆了来自抗磺酰脲类(SU)除草剂油菜种质M342的ALS基因,并用于油菜遗传转化的筛选标记,成功获得转基因耐除草剂油菜植株。研究发现油菜下胚轴外植体愈伤及不定芽的诱导对除草剂氯磺隆高度敏感,大于5 nm浓度的氯磺隆能完全抑制油菜下胚轴愈伤和不定芽的诱导。在甘蓝型油菜的遗传转化中,筛选剂氯磺隆的有效使用浓度范围比较广,从5～100 nm均可以用来筛选抗性愈伤和抗性芽。用10～20 nm的氯磺隆作筛选剂,具有较高的抗性芽诱导率和转基因阳性率。获得的转基因油菜表现出抗磺酰脲类除草剂的能力并能遗传。     

化学杂交剂SQ-1诱导糜子雄性不育效果研究

采用裂区试验设计, 以喷药时期为主区, 喷药剂量为副区, 探讨了用SQ-1诱导产生的雄性不育率、杂交率及自然授粉结实率3项指标评价应用效果。结果表明, 喷药时期、喷药剂量及时期与剂量一级互作显著或极显著影响不育率和杂交率。在雌雄蕊原基分化期, 喷药剂量为4.0和5.0 kg hm^-2时诱导雄性不育率、杂交率都在95％以上; 花粉粒分化形成初期, 喷药剂量为5.0 kg hm^-2时诱导雄性不育率和杂交率都在95％以上。喷药时期对自然授粉结实率影响不显著, 剂量及时期与剂量一级互作影响显著, 自然授粉结实率随着剂量的增加呈降低趋势。SQ-1用于糜子的最佳时期为雌雄蕊原基分化期, 最适剂量4.0 kg hm^-2。     

Sc2053诱导小麦雄性不育形态学和细胞学观察

应用化学杂交剂Ｓｃ２０５３诱导小麦雄性不育的形态学和细胞学特征观察结果显示，经处理的小麦植株变矮，植株及麦穗呈现浅绿色，穗子呈爆裂状，花药不开裂，呈现雄性不育株的形态特征，这些特征可做为估算小麦群体化学杀雄效果即绝对不育率的依据。经Ｓｃ２０５３处理的小麦雄性不育有无花粉和花粉败育两种类型。无花粉型是在小孢子刚形成时发生败育，从而是产生无花粉的空壳型花药。花粉败育型是小孢子只发育到单核花粉，二胞花粉     

化学杂交剂诱导油菜雄性不育机理的研究——Ⅰ.杀雄剂1号对甘蓝型油菜花药毡绒层和花粉粒形成的影响

研究揭示了甘蓝型油菜花药壁发育类型属双子叶型,毡绒层为同型单起源毡绒层,又可称为分泌型腺质毡绒层。用0.03％杀雄剂1号处理9个不同发育时期的甘蓝型油莱,研究其诱导雄性不育的效果,结果表明:造胞细胞时期以前处理都是无效的,花粉母细胞以后处理才有效,尤以单核期处理效果最好,不育株率接近100％。这是由于杀雄剂1号诱导甘蓝型油菜花药毡绒层偏离了正常的发育方式,而形成异常的毡绒层,表现为毡绒层增厚,提早解体,与药壁中层分离,并由此产生各种形状的败育花粉。花粉中出现细胞质收缩、空秕,无花粉壁和药中无花粉等现象。文中还对杀雄剂1号诱导甘蓝型油菜雄性不育的作用机制进行了讨论。     

甘蓝型油菜DH群体苗期抗旱性的评价

中国油菜主产区常常受到秋冬旱和春旱危害而影响产量及品质。本文通过盆栽试验,以株高(PH)、根长(RL)、地上部干重(SDW)、根干重(RDW)、根冠比(R/S)、总干重(TDW) 6个性状的抗旱系数作为抗旱性评价指标,对甘蓝型油菜DH(doubled haploid)群体的118个株系及其亲本进行苗期抗旱性评价,筛选极端抗旱DH系。结果表明,与对照相比,干旱严重抑制了甘蓝型油菜苗期的生长,6个评价指标均表现出显著差异,其中根干重的变异系数最大;在对照和干旱条件下,群体各株系各性状均表现出超亲连续分离,大部分呈正态分布,抗旱条件下的分离更为明显;相关性分析表明,地上部干重、根干重和总干重抗旱系数可作为甘蓝型油菜苗期抗旱性的主要评价指标;     

甘蓝型油菜株高性状的全基因组关联分析

适当的株高不仅是抗倒性和机械化收获的需要,而且是建立高产理想株型的需要。本研究测定来自世界油菜主产国的371份种质资源材料构成的自然群体的株高,利用60K SNP芯片对该群体进行基因型检测,获得了21 856个SNP,利用这些SNP和株高数据进行全基因组关联分析,结果表明:(1)检测到4个与株高显著关联的SNP,即Bn-A07-p3583161、Bn-scaff_22790_1-p1271170、Bn-scaff_20735_1-p42779和Bn-scaff_18702_1-p589589,分别分布于A07、C01和C02染色体;它们对表型变异的解释率分别为11.33%、11.75%、12.31%和10.97%;(2)参考基因组信息,在上述前3个SNP附近的492.0、9.5和69.5 kb处分别找到一个与株高性状相关的候选基因;(3)4个显著SNP各自的等位基因间表型均值差异分别为11.09、15.12、10.48和8.93 cm,双尾t测验结果表明各等位基因组间差异显著。     

油菜生育期动态模拟模型的构建

在13个不同熟期甘蓝型油菜品种的2年大田试验中,调查不同播期条件下各品种的生育进程及发育状态。依据油菜生理发育时间恒定原理、生理生态理论及各生育阶段与温度、光周期等外部环境关系,采用Logistic曲线描述油菜光周期效应,谐波分析法分析气温昼夜变化,分段正弦指数函数分析热效应和低温春化效应,结合上述因素构建油菜生育期动态模拟模型;确定模型光周期敏感因子、温度敏感性、生理春化时间和角果期因子4个遗传参数;模型的检验分析表明,对不同播期模拟值与观测值的根均方差平均值为2.67 d,对不同品种模拟值与观测值的根均方差平均值为3.74 d;4个遗传参数值对13个油菜品种聚类分析的结果符合品种特性。因此,该模型在一定范围内可准确揭示油菜对温、光的反应规律,具有较强的可靠性和预测性。     

人工合成具有白菜或甘蓝细胞质的甘蓝型油菜

为比较甘蓝型油菜不同细胞质基因组的遗传效应及其与核基因的相互作用,对12个白菜(2n=20)与1个芥蓝(2n=18)的正反交种间杂种分别进行子房和胚培养,人工合成白菜和甘蓝细胞质甘蓝型油菜。结果表明,白菜×芥蓝的正交子房培养杂种苗平均诱导率2.32%,甘蓝×白菜的反交胚培养杂种苗平均诱导率为1.16%。不同杂交组合之间,杂种苗诱导率差异大,但相同亲本正反交杂种获得的难易趋势相似。将单倍体杂种小苗在含0.01%秋水仙碱的MS培养基中预培养处理10d的染色体加倍效果最好,加倍率达59.32%。人工合成的甘蓝型油菜农艺性状类似于栽培甘蓝型油菜,无论正交或反交合成的甘蓝型油菜,其农艺性状介于父母本之间,但更接近于母本。合成油菜花粉育性在40.53%～88.95%之间。     

油菜籽半必需氨基酸含量的种子胚和母体植株QTL定位与分析

菜籽饼是重要的饲料蛋白质来源,氨基酸组成与饲料营养品质有着密切关系,其中丝氨酸、胱氨酸和酪氨酸为多数动物的半必需氨基酸。本研究利用甘蓝型油菜双单倍体(DH)群体分别与双亲Tapidor和Ningyou 7回交构建的2套BC1F1群体,采用新创建的双子叶作物种子品质性状遗传体系QTL定位软件和作图方法,对油菜籽丝氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量进行了种子胚和母体植株2套遗传体系的QTL定位分析。结果表明,在A1、A4、A7、A8、A9、C2、C3和C9染色体上检测到5个丝氨酸含量QTL、2个胱氨酸含量QTL和5个酪氨酸含量QTL,分别解释59.34%、29.66%和59.26%的表型变异。其中5个QTL属于主效QTL,均能解释10%以上的表型变异。全部QTL均具极显著的胚和母体加性主效应,其中3个QTL具显著或极显著的环境互作效应。在A4染色体上发现1个QTL簇,该区域存在3个控制丝氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量的QTL。一些重要QTL以及与之紧密连锁的分子标记在今后图位克隆和分子标记辅助选择育种中具有重要的利用价值。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

甘蓝型油菜与播娘蒿原生质体融合杂种后代的遗传研究

甘蓝型油菜(2n=38)与播娘蒿(2n=28)原生质体融合杂种F₁连续自交3代,获得F₂、F₃和F₄后代。用细胞学和SSR分子标记方法,分析杂种后代的染色体数目变异、减数分裂行为以及播娘蒿遗传成分的保留情况。结果表明在F₂、F₃和F₄代中,根尖细胞染色体平均数分别为38.47±3.17、37.65±3.23和36.66±2.95,随着自交世代增加呈减少趋势;在杂种后代减数分裂中,观察到染色体桥、染色体落后、染色体周期不同步、不均等分离等现象;杂种后代F₂、F₃和F₄代中检测到播娘蒿特征条带的平均频率分别为9.62%、2.99%和0.31%,呈减少趋势。因此要实现播娘蒿种质向油菜渗入应该重视F₂世代的选择。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析

菌核病是油菜主要病害, 至今尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。本研究利用qRT-PCR法比较了抗病品种宁RS-1和感病品种APL01在接种核盘菌后0~48 h内11个防御相关基因的表达差异, 以揭示抗病品种宁RS-1的抗病机制。结果表明, 4个基因(PGIP、Cu/ZnSOD、OXO和GLP)在核盘菌诱导前后抗、感品种内表达量均较高, 且抗病品种的表达量显著高于感病品种, 尤其是PGIP基因, 抗病品种宁RS-1在24 h的表达量为诱导前的170.4倍, 而感病品种仅为诱导前的3.5倍, 该时期抗病品种PGIP的表达量为感病品种的1299.4倍;2个基因(LOX2和PDF1.2)在诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 但抗、感品种间表达量差异显著;5个基因(FeSOD、PAL、EDS1、PR1和EIN3)诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 且抗、感品种间的表达量差异不显著。推测抗病品种宁RS-1对菌核病的抗性可能是由于PGIP的上调表达, 抑制了核盘菌PG蛋白对侵染部位油菜组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜菌核病的发生与蔓延。     

BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性

植物MAPKs (mitogen-activated protein kinases)在多种生物和非生物胁迫中起重要作用。课题组前期克隆了甘蓝型油菜BnMAPK1基因,并获得BnMAPK1超量表达植株。本文以甘蓝型油菜中油821DH系为对照,以超量表达BnMAPK1的转基因油菜为试材,采用离体叶片接种的方法,测定染病叶片病斑的大小及病斑周围叶片的草酸含量,并用qRT-PCR检测转基因植株4个病程相关蛋白(OXO、Cu/ZnSOD、PR2、PR3)编码基因在核盘菌胁迫下的相对表达动态变化。结果表明,甘蓝型油菜BnMAPK1超量表达可显著抑制核盘菌对离体叶片的侵染,控制染病叶片内草酸毒素的积累,可能可以解除核盘菌对OXO表达的负调控,使另外3个病程相关蛋白基因(Cu/ZnSOD、PR2、PR3)表达上调。表明BnMAPK1超量表达可有效提高油菜菌核病抗性。     

甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立

利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒pCNR与Δ6脂肪酸脱氢酶基因插入到植物的高效表达载体pCAMBIA2301G。利用在Murashige和Skoog培养基(含有200 mmol L^–1乙酰丁香酮)培养5~7 d的下胚轴外植体与农杆菌株LBA4404共培养63~69 h (pCNR),再于芽诱导培养基上培养3个月诱导芽再生。在最佳条件下,平均转化效率约为1.3%。转化植株的GUS分析和PCR分析结果表明,外源基因成功导入甘蓝型油菜。Southern杂交表明,这些转化子含有目标基因1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸,γ-亚麻酸含量达8.2%。