表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG^-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK^-／gI^-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoR V／StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRV。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRV,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白的研究进展

伪狂犬病病毒是多种家畜和野生动物均可感染的疱疹病毒。近年来，对伪狂犬病病毒分子生物学的研究取得了很显著的进展，尤以PRV糖蛋白研究最深。本文对目前已发现的11种糖蛋白的基因定位、结构及功能进行了较详细的综述。     

伪狂犬病病毒Fa 株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶NcoI消化含有伪狂犬病病毒(PRV)Fa株BamHI-7片段的质粒PBB7,以低融点琼脂糖回收目的片段,经连接并转化 E.coli DH5a,获得缺失了gI和部分gp63基因的重组质粒PPB7-1.将PRVFa与PPB7-1DNA共同转染PK15单层细胞,待出现50%以上细胞病变时收获病毒,并以蚀斑法得到纯化重组病毒株,命名为PFDI/D63.小鼠试验证实,缺失株对小鼠具有一定的免疫原性.     

伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建

对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA SphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游PK基因，下游gD基因部分编码区的约2．6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中，获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP-N1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点，利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区约9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区的400bp的缺失，构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni。序列分析进一步证实：有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础。     

伪狂犬病毒PK基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK/gI缺失疫苗株为亲本株,提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段。将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA。用限制性内切酶SacⅠ NdeⅠ缺失质粒P8-AA中PK基因的2 218 bp片段,在此缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-CI-VP1中含绿色荧光蛋白基因和VP1基因的完整表达盒,构建出可用于同源重组的转移载体P8-EGFP-VP1。     

表达猪细小病毒VP2基因重组伪狂犬病毒转移载体的构建

根据已发表的细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)NADL-2株全基因序列,设计1对引物,用PCR方法扩增出PPVVP2基因,将其克隆入pGEM-T载体中,获得了VP2基因的转移载体质粒,命名为pVP2。对含伪狂犬病病毒Min-A株gD、gI、gE、11K全基因,gG、28K基因部分编码区的质粒pPR128进行改造,用StuⅠ和SphⅠ双酶切,切去部分gI,gE基因。把两端带有StuⅠ和SphⅠ酶切位点的细小病毒VP2基因插入,构建了含VP2基因的转移载体pPR-VP2。     

猪伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

【目的】进一步了解猪伪狂犬病毒新流行株的遗传特征。【方法】对从安徽某猪场分离的1株猪伪狂犬病病毒(PRV)AH株进行遗传进化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析。【结果】PRV AH株与国内2011年以来的流行毒株非常相似,但与Bartha株及其他国外毒株遗传关系较远;国内流行毒株与Bartha株及其他国外毒株相比,其主要糖蛋白均存在明显的连续氨基酸的缺失和插入,且部分突变位点位于这些糖蛋白的重要功能区。【结论】从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据。     

猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒杆菌中的表达及优化

为在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD(Glycoprotein gD of porcine pseudorabies virus)的可溶性表达,通过启动子、底盘菌株和发酵条件的优化,提高gD在C.glutamicum中的表达量,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot方法进行表达产物的分析与鉴定,用镍离子亲和层析柱纯化产物。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,gD在谷氨酸棒杆菌表达系统获得正确表达,相对分子质量约4.5×10⁴,可与猪抗gD阳性血清特异性反应。摇瓶培养下最优发酵条件为诱导温度30℃,诱导时长24 h,优化后gD质量浓度可达到517 mg/L。     

狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白融合基因原核质粒的构建与表达

试验将编码狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白融合基因克隆到原核表达载体pET-32a( )中,构建狂犬病病毒原核表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达出约2.09×104D的狂犬病病毒糖/核融合基因编码的蛋白质。Western-blotting检测结果表明,该融合蛋白质具有免疫原性。     

重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

分子生物学技术的发展,使得疫苗研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡,特别是以病毒和细菌为活载体疫苗的研制,以期克服常规疫苗在免疫时出现的毒力返强和散毒、免疫效率较低、过敏反应、用量较大等弊端.     

伪狂犬病毒PK/gG/GFP重组转移载体的构建和表达

在构建了含伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)湖北株部分PK基因和gG基因转移载体的基础上，利用平端连接的方法将绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入到缺失的部分，并在下游引入了1个多克隆位点，构建了重组转移载体KGDF。用限制性内切酶鉴定重组转移载体KGDF。根据质粒EGFP-C1中的GFP基因序列设计1对引物鉴定GFP表达盒插入的正确性。用脂质体转染试剂盒将KGDF和PRVFIB的基因组或病毒共转染BHK-21细胞，在荧光显微镜下将出现病变的荧光斑挑出得到重组病毒。将重组病毒扩大培养后提取基因组鉴定重组病毒中的GFP基因，并通过挑取病变的荧光斑的方法纯化重组病毒。     

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)疫苗株的构建(初报)

采用磷酸钙转染系统 ,将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA2 15株DNA与PP6 3LacZE2DNA共转染Vero细胞 ,获得SA2 15 (A) 1、SA2 15 (A) 2和SA2 15 (A) 3等 12个重组病毒株。以光生物素标记的HCVE2基因为探针进行初步鉴定后 ,挑选SA2 15 (A) 1株作BamHⅠ酶切和southern转印杂交鉴定 ,结果表明构建是成功的 ,将其命名为SA2 15(A)。直接荧光抗体检测、SDS -PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCVE2基因在重组病毒内获得表达 ,产生大小约 5 1kd的蛋白。对SA2 15 (A)株进行部分生物学特性研究 ,培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK2 1和鸡胚成纤维细胞等多种细胞 ,但对不同细胞系表现有一定的差异。     

禽流感病毒 HA 基因在狂犬病毒中的表达

为了研究狂犬病毒作为载体表达外源基因的特性,将禽流感病毒 HA 基因插入狂犬病毒全基因组cDNA感染性克隆pHEP-3.0 G基因与L基因的假基因位点,再通过反向遗传技术,获得了携带流感病毒 HA 基因的嵌合狂犬病毒(HepFHA),并进行了病毒传代与 HA 基因表达的研究. 结果显示,重组病毒经BHK-21细胞传代10次,病毒表达稳定,但各代次常规红细胞凝集试验均为阴性; Western blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达,其相对分子质量为39 540,与HA裂解的HA1蛋白相对分子质量相吻合.     

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒(CVS、3aG株)及2株街毒(Sx、PB3)的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列.DNAstar软件分析表明:2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100％,2株固定毒株同源性为84.2％,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9％和73.7％;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4％ ～ 84.2％,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100％.对糖蛋白信号肽疏水区(-15位到-4位)的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒.     

通用山羊痘病毒TK基因缺失转移载体的构建

用PCR方法克隆了山羊痘病毒疫苗株(GTPV-TY)的TK基因,根据TK基因结构,设计了2对引物分别扩增得到与TK基因部分相邻的长度约1kb的同源重组臂序列,分别插入到pGEM-Teasy载体,通过SmaⅠ位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGHpolyA信号以及LacZ基因,构建了通用山羊痘病毒TK基因缺失转移载体pdTK.此转移载体为改造GTPV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗奠定了基础.     

狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救

为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因（G）从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒（RV）糖蛋白基因从野生型的第4位（N-P-M-G-L）重排于第1位（G-N-P-M-L）,并成功地拯救已发生基因重排的狂犬病毒．     

表达猪2型圆环病毒ORF2蛋白的重组伪狂犬病毒的生物学特性研究

为了探讨重组伪狂犬病毒TK-/gG-/ORF2 作为疫苗候选株的潜在价值,对该病毒的增殖特性、遗传稳定性、安全性、免疫原性及保护力进行了研究.结果表明:重组病毒的增殖滴度与亲本株相当,遗传稳定性良好,以100倍的免疫剂量接种小鼠时对小鼠是安全的;重组病毒在免疫小鼠后可诱导小鼠产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答,并且对致死剂量(100LD50)PRV Ea株强毒的攻击具有100%的免疫保护效果.     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。