紫苏苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆及序列分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）是迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸支路的关键酶,它催化苯丙氨酸生成肉桂酸,完成该支路第一步反应。本实验利用同源克隆方法成功克隆了紫苏PAL基因cDNA片段,命名为PerPAL-1（GenBank登录号：HQ388347.1）,该片段长399 bp,编码133个氨基酸。通过氨基酸序列比对分析,发现其氨基酸序列与丹参和藿香PAL该片段的同源性分别高达96%和95%。PAL系统进化树表明PerPAL-1与唇形科植物的PAL亲缘关系最近。PerPAL-1基因在叶中表达最强,根中次之,而在茎中表达最弱。     

夹竹桃苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析

首次从夹竹桃中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA片段,并命名为NoPAL1,GenBank登录号为AY747677,这也是首次从夹竹桃花青苷代谢途径中克隆得到的基因。NoPAL1长866个bp,编码289个氨基酸。通过核苷酸和蛋白质序列多重比较发现NoPAL1与其他植物的PAL基因高度同源。NoPAL1编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点。PAL系统进化树表明,NoPAL1与乔木类植物的PAL基因聚类关系最近。克隆NoPAL1基因为利用基因工程技术来调控夹竹桃花青苷的代谢从而调控夹竹桃花的颜色提供了基因资源。     

桂花苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

利用一对简并引物,从桂花(Osmanthus fragrans)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA片段,命名为OfPAL,GenBank登录号为GU991822.OfPAL长866 bp,编码288个氨基酸.通过核苷酸和蛋白质序列多重比较,发现OfPAL与其他植物的PAL基因高度同源.OfPAL编码的蛋白质序列包含与橄榄、烟草、辣椒PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点.PAL系统进化树显示,OfPAL与菊科植物的PAL基因亲缘关系较近.本研究通过克隆OfPAL基因,可为桂花对不良环境的抵御能力以及桂花类黄酮积累方面的研究奠定基础.     

黄灯笼辣椒CcCAD1基因的克隆与植物表达载体的构建

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)在木质素生物合成中有着重要作用,为了探讨辣椒中CAD基因在木质素合成中的作用,本研究利用RT-PCR方法从黄灯笼辣椒幼嫩叶片中克隆得到CAD1基因全长cDNA,命名为CcCAD1。序列分析表明,CcCAD1 cDNA序列全长1 074 bp,编码357个氨基酸。同源比对显示其与番茄CAD1蛋白的一致性高达96.09%。荧光定量PCR检测结果显示,CcCAD1基因在辣椒根、茎、叶、胎座和果肉中的表达量差异显著,其相对表达量为叶果肉茎根胎座。利用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切连接成功构建pBI121-CcCAD1植物表达载体,为CcCAD1基因转化以及后续的功能分析提供依据。     

苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。     

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1的克隆及表达分析

钙调素蛋白(calmodulin,CaM)作为植物细胞内介导多种功能的Ca²⁺结合蛋白,在调节植物的生长发育和抗病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆CaM基因的cDNA序列。序列分析表明,cDNA片段长713 bp,命名为PvCaM1,具有一个453 bp的开放阅读框(ORF),GenBank登录号为JN418801,该基因编码150个氨基酸,预测蛋白质分子质量为17.16 kD。蛋白质结构分析表明,PvCaM1蛋白含有4个Ca²⁺结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示,PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近,分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明,PvCaM1基因受尖孢镰孢菌菜豆专化型FOP-DM01菌株诱导表达,接种病原菌96 h,抗病品种260205根中PvCaM1基因的表达量达到最高,而感病品种BRB-130达到最低,260205叶中PvCaM1基因的表达量均高于BRB-130,而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调,在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明PvCaM1基因可能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对FOP-DM01菌株的防御反应,推测菜豆PvCaM1基因与镰孢菌枯萎病的抗病性有一定关联。     

北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累。为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)方法检测该基因在北柴胡不同组织中的表达差异。结果表明:该基因全长2 314 bp (GenBank登录号:MT349674),包含2 271 bp的开放阅读框,编码756个氨基酸。预测该基因的编码蛋白含有氧化鲨烯环化酶(OSC)超基因家族的DCTAE和QW结构域,与高氏柴胡、人参、光果甘草、白桦等植物的CAS蛋白具有较高同源性。BcCAS基因在北柴胡根、茎、叶、花等组织中均有表达,在茎中表达量最高。本研究为柴胡皂苷生物合成途径的调控研究提供帮助。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

黄瓜芽黄突变相关基因ClpP克隆及植物表达载体构建

为了获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,研究其与黄瓜芽黄突变现象的关系,本研究采用TRNzol法提取芽黄突变的黄瓜叶片总RNA,并以其为模板反转录合成cDNA第一链。根据NCBI预测的黄瓜ClpP基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到目的条带后测序,并构建植物表达载体;成功获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,并提交到NCBI。该基因编码区全长495 bp,共编码氨基酸158个。预测其理论等电点为5.22,理论蛋白质分子量为41.00356 KDa,编码的蛋白包含S14_ClpP_2保守结构域,无信号肽。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对发现与毛茛属植物的Clp蛋白酶同源性较高。并成功构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-ClpP。黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列的获得说明该基因在黄瓜中确实存在,这是首次克隆得到了黄瓜中的ClpP基因的cDNA全序列。     

苎麻生长素结合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及表达

以苎麻[Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.]栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT- PCR 结合RACE技术克隆了苎麻生长素结合蛋白ABP1基因的全长cDNA分子, 其序列全长为849 bp, 编码一段189个氨基酸的推导蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析与已报道的几种植物生长素结合蛋白有高同源性, 认为是苎麻生长素结合蛋白基因cDNA, 命名为BnABP1。半定量RT-PCR分析结果显示ABP1在苎麻三麻成熟期的茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为芽＞叶＞茎, 相对内标分子18S rRNA的表达量依次为0.755、0.632和0.360。但在根中没有检测到表达, 说明该基因更多地表达于细胞生长旺盛的幼嫩组织。     

紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析

为获得紫苏迷迭香酸合成途径中的酪氨酸氨基转移酶基因,本研究采用同源克隆的方法,根据已报道的其他物种的TAT基因序列设计并合成简并引物,成功克隆得到了紫苏TAT基因片段（GenBank登录号：JN032113.1）,该片段长为579 bp,共编码193个氨基酸残基,并命名为PfTAT。氨基酸序列比对分析发现其与彩叶草、丹参、拟南芥和罂粟的一致性分别为97%、94%、69%和58%,系统进化树分析表明PfTAT与唇形科植物的亲缘关系最近。采用半定量RT-PCR法分析PfTAT在紫苏的根、茎、叶中均有表达,且叶中的表达量较高,内源性植物激素信号分子对PfTAT表达量影响的实验表明,脱落酸、水杨酸处理均能够不同程度得上调PfTAT转录水平的表达。     

植物胆碱单氧化酶的生物信息学分析

为了研究胆碱单氧化物酶的抗逆机理,运用NCBI、Expasy、Psort、NetPhosK、TMHMM、NPSA网站和MEGA5、DNAman软件,对已在GenBank数据库中注册中的甜菜、菠菜、四翅滨藜草、山菠菜、苋菜等植物胆碱单氧化酶的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明：植物胆碱单氧化酶中Ala、Ser、Leu等氨基酸含量较丰富,属于稳定蛋白;不同植物胆碱单氧化酶的氨基酸序列具有较高的同源性(81.52%),均含有转运肽区、2Fe-S中心区和非血红素Fe离子结合区;分子进化树揭示胆碱单氧化酶有较强的保守性,可作为植物遗传分化和分子进化研究的重要依据;分子中不存在跨膜结构域,与疏水区域预测结果一致;可能受蛋白激酶C磷酸化,位点为Ser326;无规卷曲是多肽链中大量的结构元件;包含2个功能结构域,分属于Rieske家族与SRPBCC家族。本研究结果为开展胆碱单氧化酶的酶学特性及甘氨酸甜菜碱生物合成的分子机理研究提供理论参考。     

不同品种丹参质量比较

为了比较4个丹参新品种（系）（99-2、99-3、‘陕黄’和山东丹参）的质量,本研究采用HPLC-UV方法（Venusil ASB-C18柱）,分别以甲醇-水、乙腈-0.01%磷酸水为流动相等度洗脱,流速为0.8 mL/min,检测波长为270 nm和286 nm,测定了丹参中的6种成分（丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、原儿茶酸、迷迭香酸、丹酚酸B）的含量。结果表明不同品种的丹参质量差异显著,所测6种成分中除迷迭香酸外,其余5种均在99-3中含量最高,迷迭香酸的含量也仅次于99-2;‘陕黄’中只检测到4种成分（隐丹参酮、原儿茶酸、迷迭香酸、丹酚酸B）,其含量均低于其他3个品种;99-2的4种（丹参酮IIA、原儿茶酸、迷迭香酸、丹酚酸B）成分含量高于山东丹参。HPLC-UV方法测定丹参化学成分含量简便可靠;4个丹参品种（系）中99-3品质佳,质量优于其他品种,具有较高的商业价值。     

小黑杨APETALA1基因的克隆与花芽发育中的表达模式

APETALA1(AP1)基因既是花分生组织特征基因又是花器官形成发育基因,在花发育过程中起着关键作用。根据Genbank已知的AP1同源基因序列设计合成一对简并引物,以小黑杨(Popu-lus simonii×P.nigra)cDNA为模板,采用PCR方法分离克隆得到一个AP1同源基因全长,推测是小黑杨AP1基因,命名为XxAP1(GenBank accessionNo.XM₀02316040.1)。XxAP1编码249个氨基酸,开放阅读框长度747bp,蛋白质分子量28.67kD,等电点9.45。同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其他木本植物的AP1同源基因的一致性达70%以上,推测它们具有相似功能。试验分析表明,XxAP1第1至第60个氨基酸为MADS盒结构域,说明XxAP1蛋白以序列特异方式与DNA结合,具有转录调节因子功能,第75至174个为K盒结构域,它负责蛋白质与蛋白质间的相互作用,其大多数氨基酸具有亲水性,使XxAP1蛋白具有较好的水溶性,促进蛋白的流动性有利于基因的转录。采用半定量RT-PCR技术检测XxAP1在雄花芽发育过程中的表达模式,结果显...     

紫苏羟苯基丙酮酸还原酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆紫苏迷迭香酸生物合成途径中的羟苯基丙酮酸还原酶基因(Hydroxyphenylpyruvate reductase gene, HPPR),通过已报道的其他物种的HPPR基因序列设计特异性引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了紫苏HPPR基因片段,并命名为PfHPPR（GenBank登录号：HM152567.1）,该片段长为426 bp,共编码142个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,PfHPPR基因编码的氨基酸序列与彩叶草、鼠尾草和丹参的一致性分别为92%、93%和92%。采用半定量RT-PCR法分析该基因在紫苏叶中的表达最高,茎次之,根中相对较弱。内源性植物激素信号分子及外界刺激对PfHPPR表达量影响的实验表明PfHPPR的表达受脱落酸、水杨酸和UV-B信号调控途经的影响。     

促生菌CH1对黄瓜酚类物质代谢的影响及与抗猝倒病的关系

为研究植物生长促生细菌CH1（Brevibacillus brevis）诱导黄瓜对猝倒病的抗性的作用机制,采用生理生化的方法,测定了黄瓜根部酚类物质代谢中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性动态及阿魏酸、绿原酸、木质素、总酚、类黄酮含量变化。结果表明,病原菌（Pythium aphanidermatum）感染时,经CH1处理的植株根部PAL和PPO活性都明显高于未经CH1处理的,同时,经CH1处理的植株根部阿魏酸、绿原酸、木质素、总酚和类黄酮含量都高于未经CH1处理的。说明CH1是通过提高黄瓜植株体内酚类物质代谢的酶活性来激发酚类物质的积累,从而诱导黄瓜对猝倒病产生抗性。     

水杨酸诱导辣椒抗疫病生化机制的研究

对水杨酸（SA）处理及其挑战接种辣椒疫霉菌的4个抗性不同的辣椒品系体内木质素含量和多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定结果表明：SA诱导的供试品系与未经诱导的相同品系相比,木质素含量增高,PPO、POD、PAL活性增强,其中木质素的含量与抗病性呈显著正相关;挑战接种后两者相比,SA处理的供试材料的木质素含量和PPO、POD、PAL活性的增强幅度更大,其中抗、耐病品系的增加早且增加幅度高于感病、高感品系。值得注意的是,经SA诱导的各供试品系接种后木质素含量与抗病性也呈显著相关。木质素含量与相关酶活性的上述变化趋势与SA对各品系的诱抗效果完全吻合。     

烟草Ⅰ型几丁质酶的生物信息学分析

旨在对烟草Ⅰ型几丁质酶进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步研究烟草Ⅰ型几丁质酶在烟草抗病过程中的作用奠定基础。采用生物信息学的方法,对已在NCBI 上登陆的烟草、拟南芥、水稻、菜豆的Ⅰ型几丁质酶(chitinase,ChiⅠ)氨基酸序列特征和进化关系进行了预测和分析。结果表明,这4 种植物Ⅰ型几丁质酶的分子量大小在28~37 kDa之间,均具有信号肽,结构域高度保守,均具有几丁质结合区(Cht BD1)和催化功能区(Glyco_hydro_19);烟草中的3 种Ⅰ型几丁质酶序列相似性较高,可以聚为一类;烟草与拟南芥和菜豆中的一种ChiⅠ遗传距离较近,而与水稻中ChiⅠ的遗传距离较远。通过分析发现,烟草Ⅰ型几丁质酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究烟草抗病蛋白提供理论依据。