鸭MHCⅠ轻链cDNA克隆及其蛋白的二级结构分析

为了阐明鸭主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)的结构并推进其功能研究,采用Full RACE PCR法从鸭淋巴细胞cDNA文库中克隆了鸭MHCⅠ轻链(Anpl-β2m)cDNA,GenBank登陆号为AB246408。随后,采用pMAL-p2X/E.coliTB1原核表达系对Anpl-β2m成熟肽基因进行了可溶性表达,表达的融合蛋白命名为MBP-β2m。融合蛋白经过Amylose树脂亲和层析纯化、Western blot分析和蛋白酶切割后,用圆二色谱测定了其二级结构,并同源模建了Anpl-β2m蛋白的三级结构(3D)。cDNA克隆结果显示Anpl-β2m cDNA长792bp,包含18bp 5'端和414bp 3'端非翻译区。其ORF为119个氨基酸(aa),包含20aa信号肽和99aa成熟肽。成熟肽序列的第25位和80位为半胱氨酸(C),第80位半胱氨酸附近的“YTCRVDH”序列与免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”相符。氨基酸序列与鸡、鱼、蛙、人和鼠等的β2m基因比较,同源性30.3%~65.9%之间。圆二色谱测定结果显示Anpl-β2m蛋白呈典型的β折叠结构,α螺旋、β折叠、转角和随机卷曲含量分别为0、50、23和26。同源模建显示Anpl-β2m蛋白三级结构(3D)与人和小鼠β2m3D结构类似,由7个β片层组成,不含α螺旋。     

红外光谱法研究铬对酵母细胞内蛋白二级结构的影响

利用氨水、Sephadex G-75对富铬酵母、空白酵母进行蛋白提取,采用红外光谱测定及数学方法对比分析铬作用前后蛋白质二级结构的变化,探讨铬对蛋白结构的影响。结果显示,铬与蛋白的键合导致大分子蛋白中的α-螺旋结构和无规则卷曲结构被破坏,α-螺旋结构由11.35%降至1.63%,无规则卷曲结构略有下降,β-转角结构增加,由33.88%升至52.72%,β-折叠结构几乎无变化;小分子蛋白的β-折叠结构被破坏,由61.41%降至48.54%,无规则卷曲和α-螺旋结构比例增加,由1.41%增加至13.30%,α-螺旋结构略有增加,β-转角结构几乎无变化。与铬结合的大分子蛋白中,β-转角结构占优势;与铬结合的小分子蛋白中,β-折叠结构占优势。     

绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)cDNA克隆与组织表达分析

热休克蛋白(HSP)与生物机体的耐热性能相关。为研究不同热应激模式下与热应激恢复过程绍兴鸭热休克蛋白90基因(HSP90)mRNA在不同组织中表达差异,阐明HSP90基因的热应激保护的分子机理。本研究采用RT-PCR方法从绍兴鸭(Anas platyrhynchos)肝脏组织中克隆HSP90 cDNA序列(GenBank登陆号:JQ837244),编码区序列长度为2211bp,编码736个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,绍兴鸭与家禽(北京鸭、火鸡、鸡、日本鹌鹑)和哺乳动物(大猩猩、人、牛、灰狼等)的基因序列分别有92.6%～99%和80%～88%的同源性;荧光定量PCR结果发现,30℃长期应激能显著提高绍兴鸭垂体中HSP90 mRNA表达量;35℃长期应激能显著提高心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平;40℃急性热应激时,心脏、肝脏、肾脏、垂体和胰腺中的HSP90 mRNA表达量达到最高值。恢复性实验表明,热应激恢复1h肝脏和心脏中HSP90 mRNA表达水平最高,均于3h降低到应激前水平。心脏、肝脏与垂体中HSP90 mRNA表达水平与热应激强度显著相关。本研究为以HSP90 mRNA表达水平为衡量指标进行绍兴鸭热应激预防与控制提供资料。     

植物甜蛋白马宾灵（Mabinlin Ⅱ）的二级结构及其B细胞抗原表位预测

马宾灵（MabinlinⅡ）是中国所特有的植物甜蛋白,在目前已知的7种植物甜蛋白中具有最佳的热稳定性,将其作为新型甜味剂有着广阔的市场前景。本研究以马宾灵的氨基酸序列为基础,采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测马宾灵的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测马宾灵的蛋白质骨架区柔韧性,采用Kyte-Doolittle方法预测马宾灵的蛋白质疏水性,采用Emini方法预测马宾灵的蛋白质表面可能性,采用Jameson-Wolf方法预测马宾灵的B细胞抗原表位。分析结果表明,马宾灵的A链多形成转角和无规则卷曲结构,A链的N端27～30区段形成较柔软的蛋白质骨架结构,A链的N端4～6、7～9、10～11、12～14、20～22、23～26和30～33区段为抗原位点的可能性较大;马宾灵的B链多形成β折叠和转角结构,B链的N端0～7、9～13、28～29、33～34、40～45、53～54和55～57区段为抗原位点的可能性较大。本研究以生物信息学手段分析预测马宾灵的二级结构及其B细胞抗原表位,为设计马宾灵多克隆抗体以检测马宾灵在不同生物反应器中的表达研究提供参考数据。     

绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA的克隆、表达及其结构模拟分析

为探讨绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)在不同生长阶段背最长肌中的表达特性,本实验以成年小尾寒羊(Ovis aries)皮下脂肪组织总RNA为实验材料,在脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA保守区域设计1对引物Ff和Fr,采用RT-PCR方法克隆了绵羊FABP4全编码序列,并运用生物软件对FABP4蛋白空间结构进行分析.同时运用实时荧光定量PCR法,对FABP4在皮下脂肪和背最长肌中的表达以及不同日龄在背最长肌中的表达量与背最长肌肌内脂肪含量的相关性进行了初步研究.结果表明:绵羊FABP4基因cDNA长度为464bp,包含1个由399 bp组成的开放阅读框,编码132个氨基酸.生物信息学分析表明,不同物种间FABP4氨基酸序列具有较强的保守性,蛋白质空间结构呈2个α螺旋和10个β折叠围绕的桶状构型.实时荧光定量PCR试验表明,FABP4基因在160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量明显高于90日龄背最长肌的表达量(P＜0.05);且在90、120、160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量与相应日龄的背最长肌肌内脂肪含量呈正相关(R2=0.7196,P＜0.01).本研究结果表明,调控FABP4基因在背最长肌的表达是改善绵羊肉质的潜在途径.     

RT-PCR克隆籼稻叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA及序列的in silico分析

根据日本晴cab4基因序列（GenBank：AK104499.1）设计引物,用RT-PCR的方法从籼稻9311中克隆了叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA,命名为cab-9311（cab gene from 9311）。insilico分析表明：cab-9311与cab4基因同源性为99%,编码的蛋白含有244个氨基酸,与cab4基因编码的蛋白同源性为98%。蛋白分子质量为26.9kD,理论等电点为6.52。第54位～第216位氨基酸是一个典型的叶绿素a/b结合蛋白功能域（chlorophyll a/bbinding domain）。跨膜分析和蛋白质三级预测显示,该蛋白在C端有一个典型的跨膜区。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于叶绿体,是一个叶绿体内囊体膜上的锚定蛋白。     

青鳉鱼DBI基因全长cDNA的克隆与蛋白结构分析

地西泮结合抑制因子(diazepam binding inhibitor,DBI)具有抑制由葡萄糖诱导的胰岛素分泌、促进胆固醇跨线粒体膜转运和调节脂肪酸合成与代谢等多种生理功能。本研究使用反转录PCR结合RACE方法克隆了青鳉鱼(Oryzias latipes)的DBI基因全长cDNA序列。该序列全长592bp,包含长度为102bp的5'端非编码区(5'-UTR),长度为220bp的3'端非编码区(3'-UTR),和长度为270bp的开放阅读框,推测其编码89个氨基酸。同源性分析结果显示青鳉鱼DBI蛋白序列与大西洋鲑、鲤鱼、斜带石斑鱼、斑马鱼、非洲爪蟾、大鼠和人的同源性分别为82%、76%、76%、75%、72%、71%和70%,说明DBI基因在脊椎动物的进化过程中非常保守。同源建模显示青鳉DBI蛋白的4个α螺旋结构围成一个脂酰CoA结合口袋,与已测定果蝇DBI蛋白具有非常相似的三级结构。本研究结果为阐明脊椎动物在进化过程中DBI分子结构的演变规律及DBI在低等脊椎动物中的作用机理等提供了有意义的科学参考。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA（命名为HbC2）。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5＇-UTR和232bp的3＇-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

稻鸭共作对水稻部分株型结构指标的影响

水稻株型结构能够影响水稻的产量和品质。稻鸭共作能否对水稻株型结构产生影响,目前这方面的定量研究还很少。本研究通过田间对比试验,探讨了稻鸭共作与常规稻作两种处理对水稻分蘖期和齐穗期的部分株型结构指标的影响。结果表明,与常规稻作方式相比,稻鸭共作使水稻基部宽度呈减小趋势、冠层幅度呈增大趋势,最终使植株松散度显著增加,分蘖期和齐穗期增幅分别为12.2%和42.3%。稻鸭共作使水稻倒3叶和倒4叶的叶长、叶开角和披垂度减少,使剑叶和倒2叶的叶长、叶开角和披垂度增大,从而使水稻呈上披下挺的株型结构,并使叶面积主要分布于上部叶片。稻鸭共作使水稻植株的基叶高呈增加趋势,在齐穗期与常规处理达到显著性差异。稻鸭共作有利于水稻生育前期和中期的茎蘖合理发展,而且在后期可促进水稻上部功能叶片的生长,这在一定程度上有利于水稻高产的形成。     

不同温度处理对红芸豆蛋白热稳定性及结构的影响

为探究加热过程中红芸豆分离蛋白（Red Kidney Bean Protein Isolate, KPI）溶解特性和结构特性变化及评估不同温度（50～95 ℃）处理对KPI溶液热聚集特性的影响。该研究以不同温度处理KPI溶液为研究对象,采用热力学和光谱学对其热聚集特性进行分析研究。结果表明：随处理温度升高,红芸豆蛋白溶解度呈先升后降趋势,70 ℃时蛋白溶解度达到最高值82.68%,温度升高至95℃时,溶解度下降至65.63%;电泳结果显示,90 ℃处理蛋白上清液电泳图谱中出现一条分子量约为135 kDa的新条带。随温度升高,总巯基数量则呈下降趋势,游离巯基呈先升后降趋势。随温度上升,加热造成蛋白α-螺旋结构占比呈下降趋势,不规则结构占比呈上升趋势,β-折叠和β-转角变化幅度不大,而KPI内源荧光的最大发射波长呈红移趋势。研究结果为实践生产热处理过程中红芸豆蛋白结构和稳定性的变化规律和红芸豆食品热加工工艺优化和质量控制提供了理论基础。     

Multiple biological functions of novel basic proteins isolated from duck egg white: duck basic protein small 1 (dBPS1) and 2 (dBPS2)

Biological functions of duck basic protein small 1 (dBPS(1)) and 2 (dBPS(2)) were investigated by in vitro experiments. Results of agarose gel retardation assay indicated that dBPS(1) and dBPS(2) associate with RNA. Addition of NaCl or urea induced partial dissociation of dBPS(1)/dBPS(2)-RNA complex, implying that electrostatic interaction, hydrophobic interaction, and hydrogen bonds are involved in the association of dBPS(1)/dBPS(2) to RNA. dBPS(1) and dBPS(2) inhibited pancreatic lipase activity with the fifty percent inhibitory concentration (IC(50)) of 250 and 100 μg/mL, respectively. Peptic hydrolysates of dBPS(1) and those of dBPS(2) showed a potent angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibition with an IC(50) of 22.5 and 49.6 mg/L. The most potent ACE-inhibitory peptide was a nanopeptide (EKKGFCAGY) from dBPS(1) and an octapeptide (KYCPKVGY) from dBPS(2). These multiple biological functions of dBPS(1) and dBPS(2) may contribute to reducing the risk of lifestyle diseases.     

三黄鸡主要组织相容性复合体Ⅰ和β2微球蛋白cDNA分子克隆与多态性分析

克隆了13羽三黄鸡主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MUG）B区域主要表达基因座B—FⅣ（B—FSⅣ）和β2微球蛋白（β2m—S）cDNA，阐述了其分子特征与等位基因多态性。B—FSⅣ相互间氨基酸同源率为82．0％～99．2％，都保留了人HLA—A2与抗原多肽结合的7个关键性氨基酸。与来航鸡B—FⅣ比较，B—FSⅣ抗原多肽结合区（α1和α2区域，PBD）仅有12个高置换率位点，其中，9位和113位置换率大于或等于8；其氨基酸置换的位点数小于来航鸡B—FⅣ。根据遗传距离，将B—FSⅣα1区聚类为5个系谱（A～E）。比较发现B-FS07的α2区与抗马立克氏病的B—F21同源率高达91．2％，B-FS01的α1区与抗劳氏肉瘤病的B-F2同源率高达93．2％。另外，三黄鸡β2m与来航鸡β2m的同源率为81．2％～99．2％。结果揭示了三黄鸡MHC classⅠ和β2m cDNA均具有其品系特征。     

鸡MHC I α-生物素化序列融合基因的构建、表达及纯化

实验克隆了莱航鸡(Gallus gallus )MHC I α (BF2)(GenBank登陆号：AY989897)全基因，分析了其信号肽序列，构建了缺失信号肽且拼接了BirA底物肽序列(BSP)的融合蛋白重组表达载体pET-BF2-BSP，在大肠杆菌(Escherichia coli )中得到表达，并优化了诱导剂浓度、起始诱导菌体浓度及诱导时间等表达条件。SDS-PAGE分析结果表明所得融合目的蛋白约为40 kD，Western-blot结果显示该重组蛋白成功融合了6×His标签；pET-BF2-BSP最优化表达条件分别为：菌体起始诱导浓度OD600nm 0.8~1.2，IPTG诱导浓度1.1 mmol/L，诱导时间2~4 h；建立了该重组蛋白变性状态下通过镍柱亲和层析纯化包涵体的方法。实验获得了高纯度的在体外构建鸡MHC-肽四聚体所需的重组蛋白BF2-BSP。     

Purification, characterization, and cDNA cloning of a myofibril-bound serine proteinase from the skeletal muscle of crucian carp (Carassius auratus)

A myofibril-bound serine proteinase (MBSP) was highly purified from the skeletal muscle of crucian carp (Carasius auratus) by acidic treatment of myofibril solution and chromatographies on Q-Sepharose and benzamidine-Sepharose 6B. MBSP revealed a main protein band of approximately 28 kDa on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and was particularly inhibited by serine proteinase inhibitors. Substrate-specificity analysis revealed that the enzyme specifically cleaved at the carboxyl side of arginine and lysine residues, suggesting the characteristics of a trypsin-type serine proteinase. MBSP gene was cloned on the basis of the N-terminal sequence and the conserved active site peptide of serine proteinases together with 5'-rapid amplification of cDNA ends (5'-RACE) and 3'-RACE. The coding region gave an amino acid sequence of 242 residues including the initiation methionine and a signal peptide of 20 residues. Amino acid residues of His60, Asp106, and Ser196 consisting of the catalytic triad of serine proteinases were conserved in the sequence. Crucian carp MBSP shared relatively high identities with other serine proteinases, especially in well-conserved regions.     

Identification of goose (Anser anser) and mule duck (Anasplatyrhynchos x Cairina moschata) foie gras by multiplex polymerase chain reaction amplification of the 5S RDNA gene.

Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the nuclear 5S rDNA gene has been used for the identification of goose and mule duck foie gras. Two species-specific reverse primers were designed and used in a multiplex reaction, together with a forward universal primer, to amplify specific fragments of the 5S rDNA in each species. The different sizes of the species-specific amplicons, separated by agarose gel electrophoresis, allowed clear identification of goose and mule duck foie gras samples. This genetic marker can be useful for detecting fraudulent substitution of the duck liver for the more expensive goose liver.     

Purification, cloning, and identification of two thaumatin-like protein isoforms in jelly fig (Ficus awkeotsang) Achenes

Jelly curd used for a popular summer drink in Taiwan is prepared by extracting the pericarpial portion of jelly fig (Ficus awkeotsang Makino) achenes. The two most abundant proteins found in jelly curd have been identified as a pectin methylesterase and a chitinase. A method was developed to purify the next abundant protein by 40% ammonium sulfate precipitation and flowing through Mono Q chromatography. In sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analyses, the purified protein migrated as a polypeptide of 20 kDa in the absence of beta-mercaptoethanol but split into a minor polypeptide of 20 kDa and a major polypeptide of 27 kDa in the presence of this reducing agent. Two cDNA fragments encoding precursor polypeptides of two putative thaumatin-like protein isoforms were obtained by polymerase chain reaction cloning and subsequently overexpressed in Escherichia coli to generate recombinant proteins for antibody preparations. Immunological detection and mass spectrometric analyses indicated that the two split polypeptides were thaumatin-like protein isoforms encoded by the two cloned cDNA fragments.     

广西巴马小型猪肥胖基因（leptin）成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99．06％,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84．5％以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为元义突变。