利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻

利用水稻的愈伤组织作受体, 采用PIG基因枪法, 首先成功地将Bt基因[cryIA(b)]连同抗除草剂bar基因导入栽培水稻品种中国91, 选育出纯合稳定的株系T91系. 然后将T91系与黄淮区主栽品种豫粳6号杂交, 并辅以标记基因选择, 选育出纯合稳定、综合性状优良的转Bt基因株系C48. 利用农杆菌介导的转化系统将Xa21基因转入C48, 根据标记     

水稻抗白叶枯病基因Xa21的调控机理研究进展

十年来，已经陆续鉴定的近30个白叶枯病抗性基因中先后有5个被克隆，它们是Xa21、Xa1、Xa26、Xa5和Xa27。Xa21是最早克隆的水稻白叶枯病抗性基因，也是单子叶植物中第一个克隆的抗病基因，具有广谱抗性，相关研究既有重要的理论意义，也具有重要的实用价值。     

不同Xa21转基因杂交稻组合的大田试验与分析

在北京、四川和江苏等地对Xa21转基因杂交稻进行了大田释放实验. 分别对转基因纯合的3个恢复系明恢63-Xa21、盐恢559-Xa21和C418-Xa21与各种不育系配组的23个杂交组合进行了抗性和农艺性状分析. 在不同的杂合遗传背景下转基因Xa21稳定遗传和高效表达, 所有杂交组合均具有对白叶枯病的广谱抗性. 转基因恢复系配制的杂交组合与     

水稻抗白叶枯病基因Xa14的遗传定位

Xa14是一个高抗菲律宾白叶枯病生理小种5的显性基因,Taura等将它定位在水稻第4染色体长臂末端。本研究利用中国国家基因中心的水稻第4染色体测序结果,用SSR标记对Xa14进行遗传定位,为进一步用图位克隆法克隆该基因奠定基础。利用775株IRBB14/IR24 F₂中的145株高感群体,将基因Xa14限定在SSR标记HZR970-8和HZR988-1之间的区间,与两个分子标记的距离各为0.34 cM,并找到了在该群体中与基因共分离的HZR645-4、HZR669-2、HZR669-5和HZR669-7四个SSR标记。利用763株IRBB14/珍珠矮F₂中158株高感群体,将基因Xa14限定在分子标记HZR648-5与RM280之间的区段,找到了一个与基因紧密连锁的SSR标记HZR648-5,与基因的距离为1.90 cM。将两个F₂群体的定位结果进行整合,表明Xa14位于分子标记HZR970-8和HZR988-1之间的3个BAC克隆上,并与这两个标记紧密连锁。     

转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析

在分离克隆抗白叶枯病基因Xa23研究中获得大量转基因水稻材料。为了系统研究转Xa23基因水稻的抗病稳定性和遗传模式, 本文通过逐株进行抗白叶枯病接种鉴定、PCR和Southern blot分子检测, 对一批转Xa23基因水稻植株进行了T₀代到T₂代的跟踪分析。结果表明, Xa23基因的整合和表达, 使感病受体品种牡丹江8号获得抗病性。由于Xa23基因插入受体基因组的位点不同, 同是单拷贝插入的转基因T₀代抗病植株, 其抗病程度有明显差异。T₀代植株的抗病程度, 可以准确、稳定地遗传到T₁代和T₂代。单拷贝转基因植株分离群体的抗感植株分离比接近3∶1, 表明转Xa23基因遵循孟德尔单基因遗传模式。已获得2个纯合的单拷贝转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍有差别, 将用于外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病育种。     

白叶枯病抗性基因Xa21、Xa4和Xa23的聚合及其效应分析

水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）是由水稻黄单胞杆菌引起的细菌性病害，是世界水稻三大病害之一，常年给水稻生产造成不同程度的损失。水稻受害后，叶片枯萎，影响光合作用，千粒重降低，一般减产20%~30%^[1], 严重的可减产80%^[2], 甚至绝收^[3]。培育和种植抗病品种是从根本上控制白叶枯病的有效措施^[4~6]。但长期以来，我国利用的白叶枯病抗性具有专化性，抗性基因单一，加强了病菌的选择压，必然加速新的或原来处于劣势的病原菌小种变迁，使品种失去原有的抗性^[7]。Huang等（1997）曾将多个抗性基因聚合于同一个品种（系），提高了抗性，拓宽了抗谱，这是改良和延长品种抗性的一个有效措施^[8]。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa4、Xa23聚合及分子标记检测

本研究以含Xa23的水稻品种WBB1为亲本,分别与含Xa4的恢复系杂交,对后代进行白叶枯病菌系接种及SSR分子标记检测,进行Xa23和Xa4的聚合及Xa23显性程度观察,研究结果如下:1.含Xa23亲本与不同遗传背景品种杂交,F1代经鉴别菌系C1～C7及毒力强的P6接种,表现抗谱广.2.利用SSR标记RM206进行Xa23和Xa4杂交聚合的检测,RM206与Xa23紧密连锁且共分离,在亲本间存在多态性,在后代选择中准确性好.桂99×WBB1、R402×WBB1和IR30×WBB1的F2群体中的准确率分别达到了97%、96%和98%.这说明利用SSR标记RM206对白叶枯病抗性基因Xa23进行分子辅助选择育种是切实可行的.3.Xa23与Xa4聚合体比含Xa4的恢复系对白叶枯病的抗性有很大的提高,经C1～C7菌系接种,病斑普遍在1 cm以下,抗性水平达到高抗水平.     

转Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析

在分离克隆抗白叶枯病基因Xa23研究中获得大量转基因水稻材料。为了系统研究转Xa23基因水稻的抗病稳定性和遗传模式, 本文通过逐株进行抗白叶枯病接种鉴定、PCR和Southern blot分子检测, 对一批转Xa23基因水稻植株进行了T₀代到T₂代的跟踪分析。结果表明, Xa23基因的整合和表达, 使感病受体品种牡丹江8号获得抗病性。由于Xa23基因插入受体基因组的位点不同, 同是单拷贝插入的转基因T₀代抗病植株, 其抗病程度有明显差异。T₀代植株的抗病程度, 可以准确、稳定地遗传到T₁代和T₂代。单拷贝转基因植株分离群体的抗感植株分离比接近3∶1, 表明转Xa23基因遵循孟德尔单基因遗传模式。已获得2个纯合的单拷贝转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍有差别, 将用于外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病育种。     

转Xa21基因杂交水稻选育和评价

通过基因枪转基因方法和双质粒共转化体系将Xa21基因转入优良恢复系明恢63,得到转基因系M12和M22,并进一步做田间试验、新品种选育和食用安全性评价。结果显示:M12和M22对中国的所有白叶枯病小种都表现出高度抗性,但与原受体品种明恢63相比,农艺性状上有许多变异,主要表现在:结实率、千粒重等农艺性状变差,与珍汕97A的配合力显著降低;但与温敏不育系(X07S、056S)配组的F1有较好的田间表现。通过多代回交和分子标记辅助选择,成功地将Xa21基因从M12株系转到保持系80-4B和不育系80-4A中,得到抗白叶枯病的皖21B和皖21A。并利用皖21A不育系选育出优良杂交组合抗优97(皖21A×R-18),该组合在两年区域试验和一年生产试验中产量表现突出,米质优良。对不同世代和不同遗传背景的转基因品系进行白叶枯病鉴定和Southern分析表明:Xa21基因都能稳定遗传和正常表达,连续16代的种植并没使其白叶枯病的抗性减弱或丧失,而且不论Xa21基因是纯合的还是杂合的都有相同的抗性表现。对大鼠和小鼠的饲喂试验表明:转基因大米实质上等同于非转基因大米,是安全无害的。     

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后, PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。     

杂交稻对白叶枯病菌主基因抗性的配合力分析

以８种不同胞质类型的不育系及其保持系与９个恢复系配制的７２个不育系杂种及保持系杂种为材料,研究了杂交稻对白叶枯病菌主基因抗性的配合力。结果表明,杂交稻的抗性以主基因抗性为主,但同时也受双亲中与抗性有关的其他加性、显性及上位性基因效应的影响。说明杂交稻的抗性强弱取决于双亲抗性基因互补和累加程度高低。     

水稻抗白叶枯病基因Xa23的RFLP标记定位及其STS标记的转化

用水稻抗白叶枯病基因Xa23的近等基因系CBB23与其感病轮回亲本金刚30（JG30）杂交,构建了包含2562个单株的F₂作图群体。用水稻白叶枯病广致病菌系P6进行抗性鉴定表明,F₂植株抗感分离比严格符合3：1。根据日本水稻基因组计划RGP水稻高密度图谱上的RFLP探针对F₂群体中的145个感病单株进行RFLP检测和连锁分析,获得了6个与Xa23紧密连锁的RFLP分子标记。其中RFLP标记C1003A靠着丝粒一侧,与Xa23的遗传图距为0.4cM,为Xa23的图位克隆奠定了重要基础。并将标记C1003A成功地转化为STS标记,为分子标记辅助选择育种（MAS）提供了方便有效的分子标记。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的克隆及遗传转化

为了构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的植物表达载体并对其进行遗传转化,以水稻白叶枯病抗性品种‘扎昌龙’(ZCL)的基因组DNA为模板,通过长片段PCR扩增得到水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因Xa31(t)-1和Xa31(t)-2的序列,采用酶切、连接的方法先将目的基因克隆至T载体,筛选正确的质粒后,再克隆至pCMABIA1300表达载体。以农杆菌介导法将构建好的重组质粒转入‘日本晴’和‘台北309’的愈伤后诱导成苗,获得了大量转基因植株,这些工作为克隆白叶枯病抗性基因并研究其功能奠定了基础。     

云南3种野生稻中抗白叶枯病基因的鉴定

白叶枯病是水稻生产上最重要的细菌性病害之一,培育抗病新品种是防治白叶枯病最经济有效的途径。然而,栽培稻来源的抗病基因数量有限,并且部分抗病基因的抗病谱窄。因此,从野生稻中发掘抗病基因,将有利于培育抗病谱广且抗病能力强的水稻新品种。本研究通过抗性鉴定和PCR分析,检测云南野生稻中的抗白叶枯病基因。结果表明,云南野生稻对2个代表性白叶枯病菌Y8和PXO99具有不同程度的抗性,疣粒野生稻甚至达到免疫的程度。功能标记检测结果显示,3种野生稻中均不含xa5、xa13和Xa21抗病基因,元江普通野生稻含Xa23和Xa3/Xa26基因或其同源基因,景洪普通野生稻中含Xa1、Xa3/Xa26和Xa27基因或同源基因,药用野生稻含Xa3/Xa26基因或同源基因,而疣粒野生稻含有Xa27抗性基因。本研究结果为进一步发掘和克隆云南野生稻中的抗白叶枯病新基因提供了理论参考。