Complete cDNA sequence and mRNA expression of dog preproendothelin-3

The full-length cDNA of dog preproendothelin-3 (PPET3) was cloned from lung tissue using RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends. Aside from the poly (A) tail, the full-length cDNA was 1976 bp. A polyadenylation signal sequence and one copy of a consensus sequence, ATTTA, which is related to mRNA turnover, was found in the 3' noncoding region. The cDNA had a 594-bp open reading frame encoding a 198-amino acid polypeptide. Regions corresponding to a bioactive mature ET3 peptide, an intermediate form known as big-ET3, and an ET3-like peptide were observed in dog PPET3. Expression of PPET3 mRNA was detected throughout the organs examined, which included heart, lung, liver, kidney, spleen, stomach, pancreas, duodenum, colon, uterus, ovary and testis.     

鲤鱼γ-2β干扰素基因组DNA克隆及序列分析

试验参考鲤鱼γ-2β干扰素(interferon γ-2β,IFNγ-2β)全长cDNA序列,在其两侧非翻译区和外显子设计2对引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得了IFNγ-2β的全长基因DNA序列。结果表明,获得的基因组DNA全长2084 bp,GenBank登录号为JX181981,序列分析结果显示该基因进化较保守,和其他物种一样都含有4个外显子和3个内含子,各外显子碱基数与哺乳动物中相对应的外显子碱基数基本相同,且外显子、内含子剪接位点均遵守GT-AG规则。     

Identification of a Splice Variant of gp100 Expressed in Canine Melanoma Tumours

Introduction:  The melanoma‐associated antigen (MAA) gp100 is a glycoprotein expressed by melanocytes and is considered to be an important target for anti‐tumour immunity in human melanoma. The aim of the current study was to characterise the canine gp100 gene with a view to its inclusion in a DNA vaccine for treatment of canine oral malignant melanoma.
Methods:  RNA was extracted from eight canine oral melanomas and seven control samples (pigmented oral mucocutaneous tissue) and cDNA synthesised. PCR was performed using human gp100 primers designed to generate a 421base pair (bp) fragment. In addition to the expected pcr product, a smaller amplicon (∼260 bp) was present in all tumours and control tissues. Both PCR amplicons were cloned and sequenced. The gp100 genomic DNA sequence was identified from the dog genome resource (NCBI).
Results:  The 421 bp fragment of canine gp100 shared 90.8% identity with human gp100. This partial sequence was located on dog chromosome 10 (CFA10_contig 2982). Further analysis, using the human gp100 gene as a reference, allowed the complete canine gp100 coding sequence to be identified from the dog genome. Sequence analysis of the small PCR product showed it to be a splice variant of gp100 with exon 5 deleted.
Conclusion:  The canine gp100 sequence has been identified and this will allow DNA vaccine constructs containing this MAA to be developed. The splice variant of gp100 with exon 5 deleted was not tumour‐specific and was expressed in both melanomas and normal pigmented tissue.     

禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆

禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。     

银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因

以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。     

传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。     

鲤鱼白细胞介素10基因组DNA克隆及序列分析

为获得鲤鱼白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)全长基因组序列,本研究利用鲤鱼IL-10全长cDNA序列(GenBank登录号:JX524550),通过在两端非编码区设计引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组为模板,使用PCR方法成功获得鲤鱼IL-10全长基因组序列。鲤鱼IL-10基因组全长2176 bp,GenBank登录号为JX524551。将所获得的序列与其他物种IL-10基因组序列相比,结果发现都含有5个外显子,4个内含子,外显子在进化上相对保守,剪切位点都符合"gt......ag"规则;序列包含540 bp的开放阅读框,编码179个氨基酸,有2段典型的IL-10氨基酸信号基序。     

虎MHC ClassⅠ基因的克隆及测序

根据猫的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子cDNA序列设计PCR引物,从基因组上成功扩增并克隆了MHCClassⅠ基因片段,命名为TLA-A。该片段全长2 820 bp,包含MHC ClassⅠ分子基因约85%的长度,包括Exon 1部分序列、intron 1、exon 2、intron 2、exon 3、intron 3、exon 4、intron 4、exon 5、intron 5、exon 6、intron 6和exon 7部分序列。与其他物种的ClassⅠ基因相比,虎与家猫、猎豹、豹猫、大熊猫、狗、马、松鼠猴、人、黄猩猩等物种的同源性依次为93.4%、91.8%、87.3%、86.4%、85.1%、85.1%、84.6%、84.3%、83.7%,种间序列差异主要表现在exon 2、exon 3两个肽结合区。     

桑树1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶基因cDNA片段的克隆及原核表达与植物反义表达载体的构建

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(RCA)对桑树的光合作用具有重要调节作用。以桑树幼叶为材料分离mRNA,反转录合成cDNA,以cDNA第1链为模板,根据RCA的保守区域设计1对兼并引物,经PCR扩增获得RCA的基因功能区中间片段。对得到的桑树RCA的cDNA片段编码氨基酸进行BLAST分析表明,其与GenBank中其它植物来源的RCA有较高同源性。将RCA的部分编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导,RCA的部分编码区在BL21菌株成功表达。将得到的RCA基因片段反向插入植物表达载体,构建了RCA基因反义表达载体pBI121-RCA,以利于进一步阐明RCA与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶相互作用和调控关系以及用基因工程手段深入探讨桑树光合作用机制。     

猪ADAR2基因全长cDNA克隆、序列特征及表达模式分析

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶2基因(ADAR2)全长cDNA序列,同时对该基因在猪不同组织中的表达规律进行探索.利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)对大白猪ADAR2基因mRNA全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR方法检测35日龄大白猪心、肝、肺、肾...     

沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的克隆鉴定与表达谱分析

为明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica热激蛋白70 (Heat shock protein 70,Hsp70)基因的序列结构及其系统进化关系,本研究通过PCR技术克隆沙葱萤叶甲Hsp70基因cDNA全长序列与基因组序列,并进行生物信息学与表达谱分析。结果显示,克隆获得了沙葱萤叶甲2条Hsp70基因GdHsp70-2(GenBank登录号：MZ853083)和GdHsp70-3(Genbank登录号：OK585088),基因全长分别为2 410 bp和2 242 bp,各自编码657和646个氨基酸,均含有3个保守的HSP70家族特征序列,预测蛋白三维结构均由N-端ATPase功能域和C-端底物结合功能域所组成;系统发育分析表明GdHSP70-2,GdHSP70-3分别与松墨天牛(Monochamus alternatus)MaltHSC70-1、玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera) DvirHSP70-2的亲缘关系最近;基因组DNA克隆获得GdHsp70-2的两段内含子序列,GdHsp70-3则不含有内含子;表达谱分析结果表明GdHsp...     

Bovine FcgammaRIII with a single extracellular domain

The full length of gene encoding Fc receptor types III for bovine immunoglobulin G (boFcgammaRIII, CD16) was obtained with PCR from the c DNA library of bovine alveolar macrophages. Through molecular cloning and sequencing it is shown that the coding gene has 507 bp and codes for 168 amino acids. There are signal peptide, transmembrane spanning domain and three potential N-linked glycosylation sites in the sequence. Compared with the boFcgammaRIII cDNA sequence cloned by Collins et al, it deletes 82 amino acids and has only one extracellular domain. It is suggested that this cDNA fragment is a special form of the gene structure of bovine FcgammaRIIIA (CD16-II).     

LA-PCR快速克隆传染性法氏囊病病毒基因组A节段全长cDNA方法的建立

从浙江省某鸡场暴发疑似传染性法氏囊病 (IBD)的法氏囊病料中分离到 1株致死率高达 70 %的强毒株 (IBDV-ZJ2 0 0 0 )。通过筛选 ,采用效果最理想的蛋白酶 K法从法氏囊中提取病毒基因组 RNA,经 L i Cl纯化后 ,优化各种反应参数和条件 ,建立了 L ong- accurate PCR(L A- PCR)一步直接扩增 IBDV A节段全长 c DNA的方法 ,得到一约 3.2 6 kb的片段。L A- PCR法能快速从病鸡法氏囊和细胞适应毒中扩增 A节段全长 c DNA,为研究各 IBDV毒株 A节段的结构和功能打下了基础。     

克隆全长cDNA的方法及其在兽药研究中的应用

综述了获取基因全长cDNA序列的方法,即全长cDNA文库的构建、cDNA末端快速扩增和电子克隆;重点介绍了Oligo-capping、CAPture、Cap-trapper及SMART构建全长cDNA文库的方法,并阐述了其在兽药研究中的应用.     

能源橡胶草GGPPS基因启动子的克隆及瞬时表达研究

以多年生宿根型草本植物橡胶草为材料,根据已获得的橡胶草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因序列设计引物,采用TAIL-PCR扩增到GGPPS基因5'上游大小为1131 bp的序列。采用PlantCare和PLACE软件分析,表明该序列不仅具有启动子的基本元件,同时还有与多个器官特异表达元件以及与胁迫相关的顺式作用元件,命名为pTkGGPPS(GenBank:KT901796)。将该序列代替pCAMBIA1304质粒上的CaMV 35S启动子序列,以GFP基因作为报告基因,构建pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明,该启动子能够驱动GFP基因表达,具有一定的活性。TkGGPPS基因启动子克隆及瞬时表达为橡胶草中橡胶合成及组织特异性研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA的克隆及序列分析

根据口蹄疫病毒基因组的结构特点以及GenBank上公布的全序列，用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物，从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段，并将扩增片段分别与T载体连接，在体外分别进行了5-半分子和3’半分子的构建。最后将5’半分子和3’半分子连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序，证实成功构建了口蹄疫病毒wFL株基因组全长eDNA分子。序列分析结果表明，供试口蹄疫病毒基因组全长为8155nt，5＇UTR长1059nt；具有一个大的读码框，其核苷酸长度为6969nt。包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因；3＇UTR长127nt，包括34nt的polv（A）。