稻瘟病菌MoRho2基因功能初步分析

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是研究病原真菌生长发育及致病机理的重要模式生物。Rho家族蛋白是一类具有GTP酶活性的GTP结合蛋白,在多种细胞信号转导通路中起着分子开关的作用。通过生物信息学方法分析Mo Rho2的理化性质、蛋白结构域等信息,并推测其潜在功能。为进一步明确Mo Rho2蛋白的功能,利用基因敲除技术获得Mo Rho2基因的敲除突变体。表型分析结果表明,与野生型菌株相比,Mo Rho2敲除突变体的菌丝生长速度、分生孢子形态、附着胞形态、产孢量、对植物的毒力等方面均无明显的差异,但分生孢子萌发和附着胞形成略滞后于野生型菌株。突变体能够产生正常的侵入栓并侵入洋葱表皮。综上所述,Mo Rho2基因可能参与稻瘟病菌分生孢子的萌发和附着胞的形成,结果为进一步揭示基因Mo Rho2的生物学功能奠定基础。     

稻瘟病菌基因表达特征及其生物信息学分析

Rho GAPs（GTPase activating proteins）是真核生物中Rho GTP酶的负调控因子之一,通过激活Rho GTP结合蛋白内在的GTP酶活性,使其加速水解成结合GDP的失活态。全基因组分析指出稻瘟病菌有8个Rho GAP成员（MoRhoGAP）,但是其功能不清。本研究利用在线工具分析了其蛋白MoRhoGAP蛋白结构域及其定点突变后的三级结构,以及MoRhoGAP的互作蛋白网络,构建了系统发育树;利用基因芯片和公共数据库分析了在稻瘟病菌不同发育和侵染阶段Rho GAP的基因表达情况,为进一步研究稻瘟病菌RhoGAP的功能提供了理论依据。     

稻瘟病菌MoYpt5蛋白互作网络预测

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)共有11个假定的Rab蛋白家族成员,本文选取了MoYpt51(MGG_06241)和MoYpt52(MGG_01185)进行了生物信息学分析。通过搜索多个大型蛋白互作数据库和文献,共得到数百个与核心蛋白互作的蛋白和互作对。利用信息处理技术和高效制图平台将这些蛋白互作对构建成互作网络,得到若干个具有生物学意义的模块。结果表明,筛选得到的互作蛋白中,有的参与了蛋白降解的泛素途径(MGG_04053等)、囊泡介导的蛋白胞内运输(MGG_01238等),有的在蛋白、染色体的组装和修饰等过程(MGG_03677等)起重要作用。大部分假定互作蛋白定位于细胞质和质膜上,为其与目标蛋白互作提供了空间可能性。     

稻瘟病菌类LxAR家族基因的预测及表达分析

在侵染水稻过程中,稻瘟病菌分泌一系列效应因子来抑制寄主免疫系统。无毒效应因子AVR Pii和AvrPiz-t的氨基酸序列含有类LxAR基序,基于此,本研究利用生物信息学技术,从稻瘟病菌基因组中筛选获得了99个含有类LxAR基序的假定效应因子(MoLLEs)。该家族蛋白都为小分子蛋白(70~300 aa),富含半胱氨酸氨基,绝大多数为未知功能的蛋白。24个蛋白含已知的功能域,可能涉及了多种生命过程,其中有9个蛋白编码植物细胞壁降解酶。通过表达模式分析发现,MoLLEs家族基因成员的表达受到饥饿胁迫、附着胞生长发育以及侵染水稻等过程的诱导,此外一部分基因受到附着胞发育关键基因PMK1调控。基因表达交叉分析表明,部分基因同时在附着胞发育和致病过程中上调表达。在与水稻的相互作用中,MoLLEs在稻瘟病菌侵染不同阶段均有上调表达,并且部分基因受亲和或非亲和反应特异性诱导。      

稻瘟病菌Rab族蛋白的结构及演化分析

运用生物信息学方法,进行稻瘟病菌基因组中假定的Rab蛋白结构分析、建立系统进化树、预测Rab蛋白可能的组织和时空表达特点.结果表明,稻瘟病菌基因组共有11个假定的Rab蛋白成员.这些蛋白均含Ras超家族典型的结构域,但具有可以区别于Cde42等Rho家族小GTP酶的特征,部分Rab成员表现出组织与时空表达的特异性;进一步系统进化分析表明,23种真菌Rab蛋白在进化树上聚成8个分枝,并显示出Rab蛋白的分化可能早于真菌种类的分化.     

湖南稻瘟病菌遗传多样性分析

利用13对SSR引物对2010年从湖南19个县(市)种植的44个水稻感病品种上分离到的169个稻瘟病单孢菌株进行了遗传多样性分析,结果在0.8的相似水平上将供试菌株划分为8个宗谱,其中L01宗谱为优势宗谱,占总菌株数的66.86％.病菌宗谱与菌株来源地及寄主品种之间关系复杂,来源于相同地区或来源于同一寄主品种的菌株亲缘关系相对较近,但不同地区稻瘟病菌生理小种分化程度不一,小种的分化程度与当地的地形地势以及该地区种植的水稻品种数量有一定关系.高海拔山区比丘陵区稻瘟病菌遗传多样性更丰富;在某一地区栽培品种组成多样化程度越高,该地区的稻瘟病菌遗传多样性越丰富.     

稻瘟病菌NAD(H)激酶的生物信息学及表达分析

对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)全基因组中可能的NAD(H)激酶进行生物信息学和表达分析。结果表明,该菌含有3个可能的NAD(H)激酶,均具有保守的ATP-NAD激酶结构域;系统进化分析显示,NAD(H)激酶随着物种的进化而进化,但重要的功能结构域相对保守;MoPOS5在稻瘟病菌各生长发育阶段和致病过程中都有稳定转录,表明其在维持正常的生长发育及定殖扩展过程中扮演着十分重要的角色。     

四川省稻瘟病菌群体遗传结构分析

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病是全球水稻生产上最严重的病害之一。利用6对SSR荧光标记对采自四川绵阳、营山、雅安、北川和武胜地区的5个稻瘟病菌群体的遗传结构进行分析。结果表明,在124个稻瘟病菌中检测出43个等位基因,平均每个位点的观测等位基因数为7.2,有效等位基因数为3.1,所有位点均显著偏离HardyWeinberg平衡。5个群体的平均观测杂合度(0.374)低于期望杂合度(0.502),暗示群体内存在因近交而导致的杂合子缺失。AMOVA分析显示,绝大多数遗传变异(81.17%)存在于群体内个体间,仅有18.83%的变异来自于群体间的差异。5个地理群体间呈现高水平的遗传分化(遗传分化系数为0.057~0.528)。Mantel检验表明,群体间的遗传距离与地理距离相关未达显著水平,说明稻瘟病菌的遗传变异呈现随机分布的空间模式。群体遗传学数据分析表明5个群体间存在不同程度的基因流(基因流水平为0.472~4.347),基于贝叶斯聚类法的Structure分析也证实了这一结果。     

稻瘟病菌致病性增强突变体B11的基因分析

 在农杆菌介导转化（AtMT）的稻瘟病菌突变体库中,筛选到一个菌丝生长增快,对大麦致病性增强的突变体B11。Southern杂交分析表明B11中T DNA为单拷贝插入。通过TAIL PCR克隆插入位点侧翼序列,序列测定与比对分析显示T DNA位于假想基因MG01679的编码区内。利用PCR的方法,克隆基因的DNA和cDNA序列。该基因开放阅读框包括1个内含子和2个外显子,编码序列的长度为696 bp,编码231个氨基酸的多肽,编码产物属于ThiJ/PfpⅠ蛋白家族。因此,将该基因命名为MgThiJ1。MgThiJ1蛋白序列与尖胞镰刀菌假想蛋白FOXG_09029有57%的同源性,与禾谷镰刀菌假想蛋白FGSG_08979有54%的同源性。MgThiJ1基因可能为致病过程的负调控因子,其具体作用机制有待进一步研究。     

稻瘟病菌一个假想几丁质酶的表达分析

为研究稻瘟病菌几丁质酶在稻瘟病菌形态建成和致病过程中的作用,对稻瘟病菌MGG_08054.6编码的一个假想几丁质酶进行生物信息学分析、基因表达及其融合蛋白分泌特性研究.结果显示:稻瘟病菌基因MGG_08054.6编码的蛋白MoChil与里氏木霉、桔绿木霉、烟曲霉、禾布氏白粉菌已知的18家族几丁质酶(EC 3.2.1.14)蛋白序列同源性大于40%,并具有几丁质酶催化区域的两个保守基序GGW和DG-D-DWE及部分几丁质结合区的活性位点,该蛋白序列经程序SignalP 3.0分析含有信号肽,在16T-17S和26Q-27S处有两个可能的剪切位点;将MGG 08054.6基因在稻瘟病菌Guy11进行过量表达,获得分泌蛋白,证明了该蛋白的分泌特性.半定量RT-PCR分析表明,该基因在不同生长发育阶段及侵染水稻阶段均有表达,其中菌丝阶段表达量最高.     

稻瘟病菌Rab5蛋白的表达及互作蛋白的初步筛选

Rab5是Rab蛋白家族成员之一,它主要负责调控胞吞作用中囊泡与早期内含体的融合。通过构建MoRab5的原核表达载体,成功诱导了pET-28a-MoRab5融合蛋白的表达,并获得了纯化蛋白,通过His Pulldown检测到一些可能与Rab5互作的蛋白。     

稻瘟病菌MGG14093基因功能的初步研究

根据之前的基因芯片分析,发现在稻瘟病菌侵染水稻的过程中,许多基因被诱导表达。MGG14093为其中一个推测为编码分泌蛋白的未知功能基因,在病菌侵染过程中该基因表达量上调2.906。利用生物信息学在线软件对该基因编码蛋白的特性进行初步分析,并通过RT-PCR扩增进一步分析该基因在稻瘟病菌侵染水稻过程中的表达动态,利用基因敲除和过量表达技术对该基因的功能进行初步研究。结果表明:该基因编码蛋白为定位于胞外的分泌蛋白,没有已知的蛋白结构域,但可能存在几处氨基酸活性位点。MGG14093基因敲除和过量表达后,对稻瘟病菌的营养生长、产孢及附着胞分化没有显著的影响,但该基因过量表达后导致病菌的致病力下降,表明该基因可能参与病菌的致病过程。本研究结果为进一步揭示MGG14093基因的生物学功能奠定了基础。     

稻瘟病菌无毒基因Avr-Pid2的分子标记及其连锁图

无毒基因的克隆与变异监测可以为水稻抗病品种布局与利用提供重要信息。将菌株GUY11和FJ81278及其有性后代接种水稻品种Pi-d2及其亲本TP309进行毒性分析。结果表明,FJ81278含Avr-Pid2,有性后代在Pi-d2上的无毒、有毒分离比例符合1:1,推断FJ81278对Pi-d2的无毒性由单一基因座控制。通过SSR标记和转座子元件标记分析,确定Avr-Pid2定位于染色体7上,并获得了与无毒基因Avr-Pid2连锁的标记Propiz-t和ms7-27/28,它们与Avr-Pid2的遗传距离分别为6.1 cM、13.0 cM。这些标记的获得将Avr-Pid2限制在第7染色体上约420 kb物理距离范围内,为进一步的克隆奠定了良好基础。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

水稻蛋白磷酸酶ABI2基因启动子的克隆和功能分析

分离了水稻PP2C家族中的一个成员OsABI2的启动子,测序鉴定后构建其GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的方法获得水稻转基因植株。GUS蛋白组织化学染色结果表明,OsABI2启动子驱动的GUS基因在水稻根茎叶中都有表达,在根中表达量最高,叶中表达量最低,而且根部分生组织区明显高于根部其他组织。另外在萌发的芽中也有明显表达。OsABI2启动子在T1代转基因植株的诱导表达的GUS蛋白活性分析结果表明,在机械损伤、稻瘟病、干旱逆境和ABA、MeJA和SA处理条件下,OsABI2启动子驱动的GUS活性都出现了明显上调。上述研究结果说明,OsABI2很可能参与了发育,生物和非生物逆境胁迫的调控。     

小麦脱水素TaDHN-2基因功能与结构分析

脱水素是一类在逆境胁迫过程中诱导表达的重要功能蛋白。为了探讨脱水素基因的生物学功能,本研究以洛旱2号为研究材料,利用RT-PCR技术克隆了小麦脱水素基因TaDHN-2,qRT-PCR分析了其在ABA诱导、PEG、NaCl胁迫处理下的表达模式,检测了TaDHN-2体外活性。结果表明,TaDHN-2可编码152个氨基酸,N端包含Y片段(VDEYGNP)及S片段(SSSSSEDDGMGGRRKK),C端包含两个保守的K片段(KIKEKLPG),属于脱水素的YnSKn亚类;表达特性分析显示,TaDHN-2受植物激素ABA诱导,属于ABA依赖的基因表达调控通路。渗透胁迫过程中,该基因在中国春和洛旱2号两个品种中具有不同的诱导表达模式,在中国春根系中的诱导表达幅度显著高于洛旱2号,而在洛旱2号叶片中的诱导表达量更高;体外活性鉴定发现,60℃高温条件下,浓度为100μg·mL~(-1)的TaDHN-2可使α-淀粉酶活性提高2倍;在4℃低温条件下,TaDHN-2在浓度大于20μg·mL~(-1)时可以提高α-淀粉酶的活性,当浓度增加到100μg·mL~(-1)时,可将α-淀粉酶活性提高为对照的1.6倍。以上结果说明,TaDHN-2蛋白具有显著的酶活性保护功能。     

玉蜀黍尾孢菌CzVelB基因功能分析

以获得的野生型和CzVelB敲除突变体菌株为供试菌株,分别对其进行生物学及致病力测定,在此基础上分析毒素和细胞壁降解酶的活性。结果表明,与野生型相比,敲除CzVelB后菌丝生长速率及颜色无明显差异,但产孢量下降56.6%,且孢子萌发率下降,萌发过程滞后1 h。致病性分析发现,敲除CzVelB后菌株致病性明显下降,病情指数、病斑大小,突变体均低于野生型。分析毒素对叶片的致病性发现,突变体所产生的毒素低于野生型产生的毒素。敲除突变体菌株ΔCzVelB及野生型菌株在活体内外均能产生5种细胞壁降解酶,其中敲除CzVelB后,5种离体病原菌细胞壁降解酶活性明显下降。分析侵染过程中5种细胞壁降解酶发现,CzVelB主要通过影响CX和PMG在接种前期12 h内起重要作用;在接种后期(72～96 h),CzVelB主要通过影响PGTE的活性调控玉蜀黍尾孢菌致病力。     

二穗短柄草异戊烯基转移酶(IPT)编码基因的进化及功能分析

细胞分裂素(CTK)是一类重要的植物激素,主要作用是引起细胞分裂,诱导芽的形成和促进芽的生长。此外,CTK能够通过参与细胞分化来调控根分生组织大小,对根系生长有负调控作用。异戊烯基转移酶(IPT)是CTK合成过程中的一个关键的限速酶,在高等植物中均以多同源拷贝形式存在。为了探寻二穗短柄草IPT基因的进化起源,并阐明同源基因间潜在的功能分化及其在根系生长过程中的生物学功能,首先,对拟南芥及二穗短柄草的IPT基因进行了序列比对和进化分析,其次,利用荧光定量的方法对二穗短柄草中各IPT基因在不同组织不同发育阶段的转录水平进行了定量分析,最后,通过构建IPT基因RNAi的表达载体,对二穗短柄草中多个IPT基因的转录进行了沉默干扰。结果表明,tRNA-IPT可能代表了IPT祖先基因的功能,而且是ATP/ADP-IPT基因的供体基因。二穗短柄草各IPT基因具有一定的组织表达特异性,大部分ATP/ADP-IPTs处于转录不活跃状态,而tRNA-IPTs在根部和叶部的表达量都很高。因此,IPT基因在单子叶模式植物二穗短柄草中可能采用了不同于拟南芥的方式发挥功能,其主要的发挥功能形式是tRNA类型。二穗短柄草转IPT-RNAi植株表现出根系增强的表型,说明在根系早期发育阶段,二穗短柄草ATP/ADP型IPT基因起到了一定的调节作用。由于IPT基因在早熟禾亚科物种中较为保守,本研究可为增强麦类作物根系发育与提高抗旱性提供必要理论基础。