热激后冰浴时间与复苏时间对化学转化法转化效率的影响

[目的]研究化学转化过程中热激后冰浴时间和复苏时间对转化效率的影响,确定简便快速的转化方法。[方法]采用2种缓冲溶液制备感受态,以热激后冰浴时间或复苏时间为变量,研究这2个因素与转化效率的关系。[结果]冰浴2 min,复苏30或40 min达到最佳转化效率;冰浴和复苏时间为0 min时仍能获得相当数量的转化子。[结论]热激后冰浴和复苏时间对转化效率有一定影响,但不是决定性因素。因此,在一般性转化试验中可以省略这2个步骤以节省时间。     

冰浴时间对氯化钙转化法转化效率的影响

确定大肠杆菌DH5α氯化钙转化法时感受态细胞与质粒混合物的最佳冰浴时间。方法:在保证其他条件一致的情况下,设置大肠杆菌感受态细胞和质粒混合物的冰浴时间梯度并建立阴性对照进行研究。结果:冰浴20 min时转化效率最高。结论:与其他冰浴时间相比,冰浴20 min时的转化效率最高,实验重复性好,成本低廉,而且操作简便,值得推广使用。     

载体浓度和感受态对大分子载体转化效率的影响

[目的]研究载体量和感受态对阳性克隆率的影响。[方法]利用引物拼接PCR技术,自行设计26条引物合成一个835 bp的目的基因,将该基因与约20 kb的大分子载体连接构成重组质粒。在1 500 ng目的基因底物量的基础上,设置50、100、150、200、250、300 ng 6个梯度载体量,得到的重组反应产物再转化入Top10F'、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6种不同的感受态中,组成36个试验组合。[结果]不同载体量阳性克隆率由大到小依次为200、250、300、150、100、50 ng,200 ng的阳性克隆率最高可达75%,平均达28.5%。不同感受态细胞阳性克隆率由大到小依次为Stbl3、Top10F'、DH5α、JM108、Epi400、SCSI,Stbl3在任何载体浓度下均高于其他感受态,平均阳性克隆率为42.4%。[结论]载体量和感受态均明显影响阳性克隆率,最佳组合为200 ng的载体分子量配合Stbl3感受态,阳性克隆率可达75%。     

高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化

采用不同的转化液制备大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞,并进行pUC18质粒的转化,考察细菌生长状态、转化液、转化的热激时间和转化后所用培养基对转化率的影响.结果表明,菌液A600nm为0.705时采用TB转化液制备感受态细胞,在42℃热激45 s,转化后采用SOC培养基振荡培养,转化效率最高,可达8.59×108 CFU/μg质粒.     

光照条件和共培养时间对大豆的遗传转化效率影响研究

选取不同大豆基因型的胚尖、子叶节和下胚轴为受体材料,运用农杆菌介导法转化GUS基因,通过对GUS基因瞬时表达率的比较,探讨大豆遗传转化的主要影响因素(光照条件和共培养时间等),以寻找适宜农杆菌和外植体的平衡点,并进一步对遗传转化条件进行优化。结果表明:提供10~16h·d-1光照均提高了转化效率,与完全黑暗差异显著;延长共培养时间,显著提高转化效率,以7~10d为宜。该结果对提高大豆的遗传转化效率有重要参考价值。     

大肠杆菌感受态细胞转化能力影响因素的研究

探讨了大肠杆菌生长状态、转化溶液浓度、保存温度、冰上放置时间对感受态细胞转化能力的影响.结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A6000.56的大肠杆菌JM109制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高.若感受态细胞要保存备用,液氮保存最好,其次-70℃,添加20%甘油利于冷冻保存,但添加保护剂对转化率有抑制作用.     

花粉管通道法转化影响因素的分析

花粉管通道法转化过程中外源基因转化途径、转化受体细胞、转化时间是重要的影响因素;结合大豆花粉管通道形成与受精过程,突出受体细胞的感受态的获得,对转化操作要点加以分析,为花粉管通道法的进一步研究指明方向.     

酵母电击转化效率影响因素研究

以酵母EGY48为材料,研究了不同培养时间(12、16、20、24、30 h)、细胞状态(OD600)、电击电压(600、800、1 000、1 200、1 400 V)及不同质粒DNA用量(1、2、5、10、15、20μg)对酵母电击转化效率的影响。结果表明:当培养时间为20 h、OD600=1.4、电击电压为1 000 V、质粒用量为5μg时,该系统转化效率最高,为后续高效文库的筛选奠定了基础。     

大肠杆菌感受态细胞的少量制备方法及转化条件研究

[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3～0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100～300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。     

不同条件下转化BHK-21细胞冻存复苏效果比较

为寻找出一种简单有效的转化BHK-21细胞冻存方法,对转化BHK-21细胞用2种冻存液和3种方法进行冻存,复苏后用台盼蓝拒染和生长曲线法检测细胞成活率。结果表明,采用2种冻存液,细胞复苏成活率无明显的差别,方法1为90%以上,方法2和3均为90%以下。方法1可用于转化BHK-21细胞冻存。     

根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法研究

研究不同培养基、转化溶液、保存方法对根癌农杆菌感受态细胞转化率的影响,确定高转化率根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法。结果表明,使用YEB培养基,单菌落接种培养过夜后以1∶100的比例扩大培养10.5 h,用20 mmol/L CaCl2＋80 mmol/L MgCl2溶液处理,所制备新鲜感受态细胞的转化率为1.59×10^5转化子/μg质粒DNA。浓度为7%的DMSO对新鲜感受态细胞保存效果较好。     

连接方法对重组效率影响的比较研究

[目的]为探索一种适于连接PCR产物和不同粘端的新方法。[方法]分别采用冻融法、割胶法、试剂盒法和牙签法连接PCR产物与质粒DNA以及酶切产物与质粒DNA,比较不同连接方法对重组效率的影响。[结果]采用冻融法和割胶法连接PCR产物与pMD18-T,其连接效率分别为94.00%和93.00%,略高于试剂盒法和牙签法。采用冻融法和割胶法连接酶切产物的重组效率分别为86.67%和88.00%,略高于试剂盒法和牙签法。牙签法简化了连接前DNA相关操作,具有较高的连接效率,完全能够满足普通连接反应,特别是粘端连接反应要求。[结论]割胶法具有很高的重组效率和转化效率,可以满足普通连接反应、文库构建对连接效率和转化效率的要求,具有一定的应用前景。     

施磷和培养时间对两种石灰性土壤无机磷形态转化的影响

采用培养试验研究了施磷和培养时间对两种石灰性土壤无机磷形态转化及其有效性的影响。结果表明:不施磷肥时,随着培养时间的延长,两种土壤各种无机磷均略有增加;施入不同数量磷肥后,两种土壤中各种无机形态磷均有不同程度的增加,但Ca2-P和Ca8-P在培养初期均急剧增加,而后Ca2-P逐渐下降,Ca8-P则为有增有减,Al-P、Fe-P、Ca10-P和O-P含量随培养时间呈持续增加趋势。     

热媒炉热效率在线自寻最优控制方法

热煤炉热效率在线自寻控制策略包括取决于热平衡的油流量控制系统和皮决于热顷线自寻优的助燃风调节系统。对热效率在线自寻最优的控制原理进行了分析,给出了控制投运条件及最优控制程序框图,实践证明,该控制系统具有性能稳定,热效率高及维修简单等优点。     

小麦遗传转化几个因素的研究

 影响小麦遗传转化的因素很多，如基因型、转化方式、表达载体上的启动子和筛选标记，以及转化后的有效筛选。为此，对小麦遗传转化的主要因素进行了研究。结果表明，针对载体上的 ＮＰＴⅡ筛选标记基因．Ｇ４１８的适宜用量为 ２５～５０ｍｇ／Ｌ，而不能用卡那霉素和新霉素，针对载体上的Ｂａｒ基因筛选标记，ＰＰＴ或Ｂｉａｌｏｐｈｏｓ的适宜用量为 ３～５ｍｇ／Ｌ，针对载体上的 Ｈｐｔ筛选标记基因，潮霉素的适宜用量为 １００～１５０ｍｇ／Ｌ；从 ２５个小麦基因型中，筛选到了扬麦１５８和扬麦１０号等几个幼胚培养力比较高的基因型；选择培养基中选择剂浓度的合理变化对于获得转基因再生植株是有益的。     

Study on the Factors Influencing the Efficiency of Wheat Transformation

Wheat transformation efficiency is closely related to several factors such as receptor genotype, constructed plasmid and selection procedure after bombardment or co-cultivation. In our study, several kinds of antibiotics, which were normally used in plant transformation to the selection genes of nptⅡ, bar and hpt,were tested for the optimal concentrations for wheat transformation. The results showed that 25 - 50mg/L of geneticin (G418) was suitable for the selection of nptⅡ, kanamycin or neomycin was not suitable for use. 3 5mg/L of phosphinothricin (PPT) or biolaphos could be used for the selection of bar, 100 - 150mg/L of hygromycin for the selection of hpt. Yangmai 158 and Yangmai 10 with high tissue culture response and good agronomic characteristics were screened from 25 potential Chinese wheat cultivars. The concentration changing of selectable agent in selection medium was helpful to obtain enough regeneration plantlets with strong root system.