用低龄动物制备高效价Et免疫血清的探讨

[目的]建立一种用低龄日本大耳白兔制备高效价迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda,Et）免疫血清的方法。[方法]先制备迟钝爱德华氏菌（Et）抗原。用日本大耳白兔作免疫动物,分2组试验,一组是2月龄组（T组）,另一组是6月龄（S组）。采取耳缘静脉注射的方法,小剂量连续多次（第1、7、14、21、27、33、41天时免疫剂量分别为O．2、0．2、0．25、0．2、0．25、0．3、0．4ml）免疫日本大耳白兔。免疫后,收集免疫血清,然后用微量凝集反应法分2次试血（第1次是免疫第33天后的第7天,采用1：20抗血清;第2次是免疫第41天时,采用1：40抗血清）,测定免疫血清抗体效价。[结果]凝集反应显示,在免疫剂量相同的情况下,第1次试血测＆免疫血清效价,2月龄组T：血清效价最高为1：640,6月龄组S1、S2和S4血清效价均达1：1280,显示6月龄组的体液免疫应答反应强于2月龄组;经继续免疫8d后,第2次试血测凸免疫血清效价可见,2月龄组的T1、T2、T3和6月龄组的S1、S2、S4免疫血清效价一样,均高达1：5120。表明此时在接受相同剂量助抗原刺激后,2月龄组和6月龄组的体液免疫应答反应已趋相同。[结论]试验中所采用的T组动物（日本大耳白兔）月龄较小,免疫后仍产生了与S组一致的高效价抗血清,说明用低龄日本大耳白兔制备高效价凰免疫血清的方法可行。     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

应用Dot-IGS快速检测牙鲆腹水病病原的研究

[目的]建立一种简便快速检测迟钝爱德华氏菌的斑点免疫金染色诊断方法。[方法]选用硝酸纤维素膜作固相载体,以胶体金标记羊抗兔IgG,根据棋盘试验,确定Et免疫血清和金标抗体最佳工作浓度,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。[结果]迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。[结论]Dot—IGS方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。     

迟钝爱德华氏菌鞭毛蛋白的提取与分析

采用不同的方法提取迟钝爱德华氏菌鞭毛蛋白(Edwardsiella Tardaflagellin,ETF),选出合适的方法提取ETF,同时制备了ETF的鼠抗血清和迟钝爱德华氏菌菌株ETY全菌的鼠抗血清,通过ELISA法和Western blottig法分析了ETF的抗原性和免疫原性。试验结果表明,酸化高速离心法可获得高纯度分子量约为44 kDa的ETF,该蛋白可被爱德华氏菌的全菌鼠抗血清识别,同时由ETF制备的鼠抗血清除了能特异识别该蛋白之外,也可识别爱德华菌菌体裂解产物中44 kDa的蛋白,证实爱德华氏菌鞭毛蛋白具有抗原性和免疫原性,可作为亚单位疫苗的候选抗原。     

广西斑点叉尾鮰爱德华氏菌的分离鉴定

在广西2处网箱和2处池塘发病斑点叉尾鮰中分离到4株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、培养特征、生理生化特性鉴定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌,通过PCR检测、PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对,进一步确定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌;致病性试验结果显示,这4株分离菌株具有较强的致病性,能引起斑点叉尾鮰发生爱德华氏菌病;药敏试验结果显示,4株分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氟哌酸等高度敏感。     

养殖大菱鲆出血性败血症病原菌致病性的研究及鉴定

从全身弥漫性出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus的腹水、肝脏和肾脏中分离到3株菌落形态相同的优势菌,编号为L-49231、L-59231、L-59232。选用L-49231菌,通过注射、浸泡和灌喂3种途径分别对两种规格(全长(12±2)cm,体重(30±2)g;全长(18±2)cm,体重(125±5)g)的养殖大菱鲆进行人工感染试验,结果证实:此菌可经上述3种途径造成该病的发生,注射和浸泡方式的感染率均为100%,死亡率分别为100%和66.7%;灌喂方式未见死亡,感染率为85.7%。该菌经革兰氏染色为阴性,杆状,大小为2~3μm×1~1.2μm,周生鞭毛,兼性厌氧,接触酶为阳性,氧化酶为阴性,V.P试验为阴性。根据《常见细菌系统鉴定手册》所描述的爱德华氏菌属的生理生化特性,菌株L-49231为迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda。     

两种致病菌对杂交东方鲀非特异性免疫和抗氧化指标影响

为研究迟钝爱德华氏菌和哈氏弧菌感染对杂交东方鲀"冀研一号"(菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂)非特异性免疫和抗氧化指标影响,分别对杂交东方鲀腹腔注射PBS、迟钝爱德华氏菌和哈氏弧菌,注射后6、12、18、24和36h分别取肝胰脏,测定其谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活力。结果表明,在攻毒后36 h内,注射迟钝爱德华氏菌"冀研一号"东方鲀肝胰脏总超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶酶活均极显著升高(P0.01);攻毒后36 h内谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽均表现升高趋势。感染哈氏弧菌后,肝胰脏中谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶活力均高于对照组;谷胱甘肽含量表现升高趋势。试验鱼体感染致病菌后,引起肝胰脏非特异性免疫和抗氧化指标变化。     

迟钝爱德华氏菌的分离鉴定及体外抑菌效果研究

从患病金鳟体内分离得到一株菌株,经16S rRNA定为迟钝爱德华菌,并对其进行体外抑菌实验研究.采用水提法、水浸法、醇提法、超声醇提法4种方法制备大黄和五倍子中药原液,并用滤纸片法和二倍稀释法测定其对迟钝爱德华氏菌的体外抑菌活性.结果表明,五倍子和大黄对迟钝爱德华氏菌均有抑菌活性,五倍子抑菌效果优于大黄.五倍子以醇提法的抑菌效果最好,其抑菌圈直径为22.617±1.493 mm,最小抑菌浓度(MIC)为7.8125 mg/mL;大黄以超声醇提法抑菌效果最好,其抑菌圈直径为(12.193±0.688)mm,最小抑菌浓度(MIC)为125 mg/mL.结论:大黄和五倍子对迟钝爱德华氏菌有抑菌作用,五倍子抑菌效果优于大黄.     

日本大耳白兔血常规及血气指标的正常值检测

[目的]使用新方法检测日本大耳白兔血常规及血气指标的正常值。[方法]选用健康3月龄日本大耳雄性白兔30只,用CD-1200全自动血液分析仪和i-TAT便携式血气分析仪分别系统测定白兔的静脉血WBC、RBC、HGB等15项血常规指标以及TCO2、PCO2、BEecf等10项血气指标。[结果]15项血常规指标检测结果分别为:WBC(7.20±1.49)109/L、RBC(6.20±0.41)1012/L、HGB(150.60±7.71)g/L、HCT(0.45±0.03)、MCV(71.80±4.05)fL、MCH(24.90±1.07)pg、MCHC(341.90±38.49)g/L、RDW(16.80±1.19)%、PLT(149.50±56.63)109/L、PCT(1.10±0.46)%、MPV(6.63±1.17)fL、PDW(15.40±1.33)%、LYM(4.70±1.04)109/L、MID(1.46±0.46)109/L、GRN(1.30±0.49)109/L;10项血气指标分别为:Na(143.250±2.193)mmol/L、K(3.210±0.371)mmol/L、TCO(2 17.130±2.330)mmHg、iCa(1.310±0.132)mmol/L、pH值7.280±0.035、PCO(2 31.71±3.88)mmHg、PO(2 56.92±6.75)mmHg、HCO3(-16.12±2.26)mmol/L、BEECF(-5.45±4.31)mmol/L、SO(2 82.40±5.62)%。[结论]该试验结果可作为教学参考,也可为相关研究提供参考。     

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda L-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况.结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank 中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99％、97％、99％、99％、99％、98％;通过优化反应条件,在退火温度为54 ℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因.表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株.     

几种不同免疫程序制备抗弓形虫高免血清的比较

用弓形虫血清抗体阴性的健康家兔,以4种不同的免疫程序皮下接种弓形虫速殖子裂解抗原制备高免血清.研究结果表明,先以完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂分别进行一免和二免,然后再以抗原进行三免或四免制备高免血清,其抗体效价高达1:4096(IHA),与每次都使用抗原的传统免疫程序制备的抗体效价相当,但所用抗原剂量减半,该法优于另外2种免疫程序.     

氯胺酮完全抗原的制备及免疫效果检测

基于盐酸氯胺酮是一种化学反应性质活泼的小分子,利用半抗原-载体效应的免疫学原理,以三氯化磷（PCl3）为桥梁,将盐酸氯胺酮分子共价连接到兔血清白蛋白（RSA）分子,随后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析偶联物,并用该偶联物免疫BALB/c小鼠,最后采用斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）检测氯胺酮抗体应答水平。蛋白电泳分析显示已成功制备出分子量约为78.8 ku、氯胺酮与RSA的分子偶联比为39的完全抗原,能诱导实验小鼠产生效价为1：1 280的抗氯胺酮抗体。本试验不仅建立了检测氯胺酮的血清学方法,还为开发氯胺酮戒毒疫苗做了有益的积累。     

仔猪水肿病高免血清的制备及初步应用

用自行研制的仔猪水肿病多价油乳剂灭活苗和蜂胶灭活菌苗,对猪进行了免疫,试制了猪水肿病高免血清,将试制的血清在湖北省内进行了试用,其对猪水肿病的治愈率达到92%,而单独使用亚硒酸钠的治愈率仅为25.0%,表明所制备的高免血清具有较高的治疗价值,可在生产中推广应用.     

小鹅瘟羊源高免血清的制备及比较

为制备高效价的小鹅瘟高免血清,试验采用从贵州某养鹩场病鹅分离的小鹅瘟野生强毒株,接种于9 d鹅胚,收集24 h以后死亡的鹅胚尿囊液,制备小鹅瘟病毒抗原,与弗氏佐剂混合均匀,多次免疫山革后,颈动脉一次性放血,离心收集血清即得到小鹅瘟羊源高免血清,以琼脂扩散进行血清效价测定,并与市售小鹅瘟鹅源高免血清进行保护率比较.结果显示,试验制备的小鹅瘟羊源高免血清抗体效价在1:8以王,对人工感染雏鹅的保护率为95%,而市售小鹅瘟鹅源高免血清的保护率只有85%.结果表明,本试验制备的小鹅瘟羊源高免血清具有效价高、成本低、安全性好等优点.     

黄芪多糖油乳佐剂新城疫灭活苗对鸡免疫功能的影响

将黄芪多糖(APS)添加到鸡新城疫油乳剂疫苗中作为免疫佐剂,分别用盐酸左旋咪唑、黄芪多糖粉剂、黄芪多糖针剂和黄芪多糖免疫佐剂等与鸡新城疫油乳剂疫苗同时使用,探讨黄芪多糖免疫佐剂对鸡免疫功能的影响。结果表明,免疫佐剂均提高了疫苗的免疫力,其中,与疫苗混合后作为免疫佐剂使用的黄芪多糖可明显促进抗体产生,提高脾和法氏囊指数以及E-玫瑰花环形成率。     

病毒性出血症疫苗免疫剂量对幼兔血清抗体效价的影响

选择35、40和45日龄的新西兰家兔各30只,每种日龄兔随机均分为5组,其中对照组注射生理盐水,4个试验组分别注射4种剂量(1 m l、2 m l、3 m l、4 m l)的兔病毒性出血症疫苗,分别于免疫前及免疫后1~7周内每周采血测定血清抗体效价的动态变化。结果表明:各日龄兔的2 m l、3 m l、4 m l剂量组的抗体上升速度和有效抗体维持时间均显著大于同日龄的1 m l剂量组;35日龄兔的2 m l、3 m l、4 m l剂量组的抗体峰值显著高于1 m l剂量组。提示35日龄兔注射剂量2 m l为最佳免疫程序。     

微生态制剂对肉鸡免疫器官发育影响的研究

将微生态制剂添加到饲料中饲喂肉鸡,检测肉鸡的免疫器官指数和免疫器官中T细胞百分数,探讨微生态制剂对肉鸡免疫器官发育的影响。结果表明,17日龄时,试验组的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数分别比空白对照组高6.76%、10.69%、11.09%,差异显著(P<0.05);49日龄时,试验组的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数分别比对照组高11.07%、19.01%、14.52%,其中胸腺指数和脾脏指数差异显著(P<0.05),法氏囊指数差异极显著(P<0.01)。另外,10、17日龄时试验组鸡的胸腺T细胞百分数分别比对照组高13.01%和6.41%;试验组10、17日龄时鸡的脾脏T细胞百分数分别比对照组高19.40%和9.71%,差异显著(P<0.05)。     

水泡性口炎病毒人工感染小白鼠的免疫病理学研究

[目的]探讨水泡性口炎病毒在动物体内的致病机制。[方法]利用H.E、免疫组织化学染色法,研究了水泡性口炎病毒感染小白鼠的免疫病理过程。[结果]病变以肺脏变化最明显,脑次之,呈肺淤血、出血、水肿及支气管肺炎变化,大脑皮质有脓性坏死灶。免疫组化染色显示,肺、脑部和脊髓出现了阳性反应,脑的阳性率高。[结论]水泡性口炎病毒对小白鼠的致病性主要表现在肺脏和脑部。