柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出706 bp的条带,不能从柑橘常见病害病原菌中扩增出任何条带。特异性引物的灵敏度检测结果表明,引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的检测灵敏度为200 pg,引物Pcc1/ITS4的检测灵敏度为20 pg。筛选的特异性引物Pc1/ITS4可以对果园疑似柑橘黑斑病病斑进行检测。因此,利用设计的特异性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4,结合简单的病原菌基因组DNA提取方法,可以在短时间内完成对病原菌的分子检测。     

水杨酸诱导鸭梨抗黑斑病效果及机理的探讨

为了揭示水杨酸诱导鸭梨抗黑斑病的作用效果及机理，以河北农业大学实验农场梨园鸭梨叶片和果实为试验材料，通过组织分离法分离、纯化梨黑斑病病原菌并对其进行致病性检测，利用形态观察及真菌ITS、HIS、RPB2、ACT多基因综合鉴定法明确鸭梨黑斑病致病菌的类型；鸭梨离体叶片通过针刺接种黑斑病菌分生孢子悬浮液侵染0,6,12,24,48,72,96,120 h,通过实时荧光定量PCR检测水杨酸信号通路中相关基因的表达量变化，通过高效液相色谱(HPLC)检测0,72 h内源水杨酸含量的变化；利用不同浓度水杨酸(0,0.002,0.02,0.2,2.0,10.0,20.0 mmol/L)测定其对黑斑病菌菌丝生长的影响；采用外源0,0.02,0.2,2.0 mmol/L水杨酸处理鸭梨果实，接种黑斑病菌并观察其抗病效果。结果表明，河北农业大学实验农场梨园中鸭梨黑斑病病原菌为链格孢属链格孢菌，鸭梨离体叶片接种黑斑病菌后，72 h游离态水杨酸含量由0 mg/g增至0.02 mg/g,结合态水杨酸含量由0.47 mg/g增至1.55 mg/g, SA信号通路中相关基因Pbrgene12425、Pbrgene6...     

大豆霜霉病菌rDNA ITS区的分子探针的设计与应用

大豆霜霉病菌是引起大豆病害的重要病原之一,采用真菌18～28 S间的内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)通用引物ITS1和ITS4扩增大豆霜霉病菌和其他外群真菌的基因组DNA,扩增出约500 bp的片段;通过克隆测序大豆霜霉病菌的ITS全序列并与GenBank中霜霉菌属其他种的ITS序列比对,设计出大豆霜霉病菌的特异性引物PM1和PM2。用此特异引物可以从大豆霜霉菌株中扩增出380 bp的特异性片段,而其余9个参试菌株和大豆组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明,可以检测到目标DNA的浓度为0.1 pg。该方法可用于快速、准确和灵敏地检测大豆霜霉病菌,为快速监测组织中霜霉病菌潜伏侵染并及早采取防治措施提供积极的指导作用。     

啶酰菌胺可作为潜在的梨黑斑病防治替代药剂

<正>黑斑病是梨的主要病害之一,近年来不少地区反映多菌灵等传统常用杀菌剂对其防治效果已出现下降。浙江农林大学农业与食品科学学院和浙江省农药检定管理所合作,从浙江、江苏和安徽3省分离了252株梨黑斑病菌,采用菌丝生长速率法检测了其抗药性发生情况。结果发现:所检测的黑斑病菌群体     

荷花腐败病菌的荧光定量PCR检测

建立一种快速、特异性强的定量检测荷花腐败病菌(Fusarium commune)的技术,评估该技术用于荷花腐败病菌定量检测的可行性,并对东莞莲湖的土壤、莲藕等样品的荷花腐败病菌数量进行动态监测,为防治该病害提供依据。采用以SYBR Green I为荧光染料的实时荧光定量PCR(qPCR)技术,对不同发病级别的荷花植株及其地下土壤的荷花腐败病菌的含量进行检测,并分析病菌含量与病害级别的相关性。结果表明,利用qPCR技术检测的最低检测限为1 fg/µL,添加健康荷花组织的基因组DNA后,该qPCR技术的最低检测限为10 pg/µL。对该qPCR反应的溶解曲线进行分析,扩增的产物仅有1个峰值,表明采用该qPCR技术扩增的DNA产物具有高度的特异性。染病植株中荷花腐败病菌的DNA含量与其发病程度呈正相关,而莲湖土壤荷花腐败病菌含量与病害级别的相关性低,但土壤中荷花腐败病菌的数量随着病害级别提高而增大。该qPCR检测体系能够对莲湖的土壤、发病莲藕等进行荷花腐败病菌的动态监测,可为该病的有效防治提供依据。     

‘砀山酥梨’芽变‘97-05-9’的RAPD分析

利用RAPD分子标记技术对37份梨种质资源进行了遗传亲缘关系及分类研究。从80个随机引物中筛选出27个引物进行扩增,应用SPSS11.0软件进行聚类分析。聚类分析结果表明:不同梨品种之间存在明显的遗传差异,‘砀山酥梨’与营养系变异‘97-05-9’具有很近的亲缘关系,归为一类。且‘砀山酥梨’与其营养系变异‘97-05-9’有14个引物扩增出18条特异性条带,变异位点较多。     

内蒙古地区番茄溃疡病菌PCR快速检测技术及22个番茄品种种子表面带菌检测

为快速检测番茄种子表面的带菌情况,以便及时有效防控番茄溃疡病,从而减少病害损失。试验用细菌基因组DNA试剂盒提取番茄溃疡病的总基因组,用通用引物进行PCR反应。以番茄溃疡病菌的DNA为模板,使用专一性引物进行PCR扩增,通过对专一性引物的筛选,最终确定了Cla F1-Cla F2为快速检测番茄溃疡病菌PCR的特异性引物。该检测方法特异性强、灵敏度高,模拟种子带菌,对浸种水的检测灵敏度达1×105CFU/m L。经PCR快速检测,22个番茄品种中只有黑贝番茄、粉红番茄和保罗塔带有番茄溃疡病菌,其余19个品种均未带菌。该方法直接对种子进行检测,不需进行病原菌分离培养,快速简便。     

葡萄苦腐病菌的分子检测方法

葡萄苦腐病菌(Greeneria uvicola)是我国检疫性有害生物.本研究根据G.uvicola的ITS基因序列,设计了PCR引物GUA-1和GUA-2以及实时荧光PCR引物GUA-P1和GUA-P2及荧光探针GUA-Probe-117.利用引物GUA-1和GUA-2进行PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄可产生354 bp的特异性片段;实时荧光PCR扩增,G.uvicola和感染G.uvicola的红提葡萄均出现强荧光信号(△Rn)增加.而葡萄上其他常见真菌样品以及健康的红提葡萄既无特异性扩增也无荧光信号增加.灵敏度测试中,普通PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.05ng/μL以上的样品,实时荧光PCR可检测到含G.uvicola DNA浓度0.0005 ng/μL以上的样品.由此确立了G.uvicola的两种稳定可靠、灵敏的分子检测方法.     

两种瓜类镰刀菌的多重 PCR 检测

为了更快更准确地在病菌潜伏期或发病初期鉴定出尖孢镰刀菌引起的瓜类枯萎病和茄病镰刀菌引起的瓜类根腐病这2种病害,根据尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的翻译延长因子TEF1-α序列设计了3条种特异性引物。引物对FO-F和Fu-R可以从尖孢镰刀菌中扩增到1条228 bp的片段,引物对FS-F和Fu-R可以从茄病镰刀菌中扩增到1条347 bp片段,并且3条引物FO-F、FS-F和Fu-R可以同时在1个PCR反应中扩增到2个片段,而这2对引物都不能从其他病原真菌中扩增到任何条带。结果表明,该多重PCR检测方法可以同时鉴定样品中的2种镰刀菌。     

早防梨树黑斑病

<正>黑斑病是梨树上的重要病害之一,在主要梨产区普遍发生,梨树整个生育期及各个部位都会发病。叶片染病,先出现小黑斑,后逐渐扩大至直径1厘米的近圆形,微带有淡紫色轮纹,湿度大时表面产生黑色霉层(病菌分生孢子梗和分生孢子);幼果染病,果面形成黑色圆形小斑,后逐渐扩大,略凹陷,产生黑霉,果实长大时果面龟裂,裂缝可深达果心。     

外源水杨酸诱导伽师瓜采后抗链格孢病害效果的研究

研究了离体条件下不同浓度的水杨酸(0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L)处理对链格孢菌菌丝生长和孢子萌发的影响,并以新疆伽师瓜为试材,在单因素试验的基础上,通过正交试验确定了外源水杨酸诱导控制伽师瓜链格孢病害的最佳处理条件。结果表明,离体条件下,低浓度(0.1~1.0 mmol/L)的水杨酸对链格孢菌的菌丝生长和孢子萌发均无显著的抑制作用;外源水杨酸诱导控制伽师瓜链格孢病害的最佳处理参数为:水杨酸浓度0.5 mmol/L,处理时间10 min,诱导间隔期48 h,该诱导处理可有效控制由链格孢菌侵染引起的伽师瓜采后黑斑病,病情指数达到最低。     

Development of an SSR marker set for efficient selection for resistance to black spot disease in pear breeding

Black spot disease, which is caused by Alternaria alternata (Fries) Keissler Japanese pear pathotype, is one of the most harmful diseases in Japanese pear cultivation. Because of the potential harm of fungicides to consumers and the environment, resistant cultivars are desired. In this study, to enable efficient marker-assisted selection in pear breeding, we conducted comprehensive inoculation tests and genotyping with 207 pear cultivars. We identified a marker set (Mdo.chr11.27 and Mdo.chr11.34) suitable for selection for black spot resistance. In most susceptible cultivars, Mdo.chr11.27 amplified a 220-bp band and Mdo.chr11.34 amplified a 259-bp band. The genotype of Mdo.chr11.34 corresponds perfectly to the estimated genotype of Japanese pears susceptible to black spot disease. Using linkage analysis, we identified the positions of the gene for susceptibility to black spot disease in Chinese pear. Mdo.chr11.27 and Mdo.chr11.34 were tightly linked to susceptibility in Chinese pear, and the susceptibility gene was mapped at the top of linkage group 11, similar to that in Japanese pear. This marker set and the accumulation of phenotypic data will enable efficient marker-assisted breeding for black spot resistance in pear breeding.     

杏贮藏过程中主要致病菌的分离与鉴定

为有效控制杏果采后贮藏中的主要致病菌,对贮藏中腐烂小白杏果实上的病菌进行了分离与鉴定。分离并筛选得到了3种主要霉菌,经过形态结构鉴定和显微镜观察,确定为粉红单端孢霉（Trichothecium roseum）、链格孢霉（Alternaria alternata）和天门冬拟茎点霉（Phomopsis asparagi）。经过回接发现,该3种霉菌能使健康杏果致病,且病状与自然发病一致,从这些病斑中又分离得到了相同的霉菌,从而确定该3种霉菌为小白杏采后的主要致病菌。     

冬枣贮藏期浆胞病病原分离与鉴定

在天津地区栽培的冬枣上发现冬枣贮藏期浆胞病真菌病害,从病果上分离出2种真菌菌株,回接后,发现病症与自然发病症状完全一致,而且从接种病果上又重新分离到了此病病原真菌,经鉴定和致病性测定,确认为链格孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissl)和裸孢壳属(Emericella nidulans(Eid.)),其中裸孢壳属(Emericella nidulans(Eid.))在冬枣上还属国内外首次报道.     

菊科植物链格孢菌分类研究进展

为明确菊科植物链格孢菌的危害及种类。本研究通过查阅、整理、分析国内外近十年的相关文献资料发现,链格孢菌可侵染多个属的菊科植物的叶、茎和花等,引起黑斑病、褐斑病和轮斑病,发生日趋严重。全世界已报道的以菊科植物为寄主的链格孢菌共54 个种类,国外已报道46 个种类,中国已报道20 个种类。本研究综述了全世界菊科植物链格孢菌的种类,为该类病害的防治研究奠定了基础。中国已报道的菊科植物链格孢菌多集中在北部,种类相对较少,且分类研究主要依靠形态学,应结合分子学方法进行系统学研究。     

Optimization of an Inoculation Method for Cotton Alternaria Leaf Spot

[Objective] Cotton Alternaria leaf spot disease causes serious damage during cotton production. The aim of this study was the optimization of an inoculation method for cotton Alternaria leaf spot. [Method] An Alternaria alternata spore suspension was used as the inoculum. Three inoculation methods were tested and compared: smearing with spores plus retaining moisture using a sealed plastic bag; smearing with spores plus retaining moisture by intermittently spraying with water; and spraying spores plus retaining moisture by intermittently spraying with water. [Result] Inoculated cotton leaves were most readily infected by smearing with spores plus intermittently spraying with water. This inoculation method was effective for distinguishing resistant cotton cultivars from susceptible ones, but often caused nonuniform disease lesions on cotton leaves; thus, the incidence of diseased leaves was random and somewhat nonuniform. Spraying spores plus retaining moisture by intermittently spraying with water led to a relatively longer disease pathogenesis and slower disease progression; however, the incidence of diseased leaves was relatively consistent and uniform, thus providing repeatable inoculation experimental conditions compared with the other two inoculation methods. [Conclusion] Spraying spores plus retaining moisture by intermittently spraying with water is a suitable inoculation method for studying cotton resistance to Alternaria leaf spot.     

毛叶枣黑斑病的病原鉴定及其生物学特性研究*

毛叶枣黑斑病菌是半知菌类链格孢属链格孢Alternaria alternaria。病菌生长和产孢温度范围10～35℃,适宜温度25～30℃;PDA培养基最适宜病菌生长和产孢;病菌在pH3～11时均能生长和产孢,pH6～7最适生长,pH5最适产孢;孢子萌发率在20～30℃和pH5～9时较高,25℃和pH为7时萌发最好;在饱和湿度再加水滴的条件下孢子才能很好萌发;1%葡萄糖液和毛叶枣汁液对孢子萌发有促进作用。     

美人蕉叶斑病病原菌的生物学特性及其抑菌药剂筛选

为明确美人蕉叶斑病病原菌（Alternaria alternata）的生物学特性以及筛选最适常用药剂,为美人蕉叶斑病的防治提供科学依据。对引起美人蕉叶斑病的病原菌进行生物学特性观察,并对其进行室内药剂筛选。结果表明：该病原菌菌丝生长的最适温度为28℃,致死温度为45℃,碳源和氮源分别以蔗糖和硝酸钠为佳,在pH为3~10的范围内均能生长,生长最适pH为7,光照条件和通气状况对菌丝生长没有明显影响。在供试的5种药剂中,10%苯醚甲环唑效果最好,在推荐的使用浓度下相对抑菌率达到100%。     

玉米链格孢菌叶枯病病原菌的分子鉴定

对玉米链格孢菌叶斑病病原菌进行了分离、纯化,并按照柯赫氏法则证明其为玉米链格孢菌叶斑病病原菌。利用PCR技术对病原菌核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer)进行扩增,并克隆、测序,测序结果显示其与GenBank中报道的细链格孢菌(Alternaria tenuis)同源性为99%,结合形态学特征,确定该病原菌为细链格孢菌。     

威灵仙黑斑病的病原鉴定及防治药剂的离体活性筛选

为明确威灵仙黑斑病的致病菌并筛选出有效的防治药剂,采用形态特征及菌株的ITS序列分析方法进行病原菌鉴定,通过平皿菌丝生长抑制法测定杀菌活性,结果表明威灵仙黑斑病病原菌为Alternaria alternata (Fr.)Keissler;25%溴菌腈可湿性粉剂、72%霜疫力克可湿性粉剂、30%爱苗乳油、80%绿亨2号可湿性粉剂和10%世高水分散粒剂对菌丝抑制率均达90％以上。此研究结果可为该病害的有效控制提供前期研究基础。