过量表达热休克蛋白C端相互作用蛋白(CHIP)抑制小鼠前成骨细胞系的分化和矿化

以MC3T3-E1细胞系为材料,体外转染pEFNeu-HA-CHIP质粒,Western blot检测热休克蛋白Hs70(HSP70)C端相互作用蛋白(CHIP)表达,建立了稳定过量表达CHIP蛋白的MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系.然后用含10 mol/L甘油磷酸钠和50靏/mL抗坏血酸的条件培养基诱导MC3T3-E1和MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系向成骨细胞定向分化,结果表明,诱导期MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系中碱性磷酸酶(ALP)的活性比MC3T3-E1细胞中的ALP活性低,ALP染色实验同时证实了这个结果;诱导培养18d后,Von Kossa染色和茜素红染色结果表明,MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙少.结果提示,过量表达CHIP蛋白抑制MC3T3-E1细胞的分化和矿化.     

小鼠颅骨成骨细胞的分离培养及生物学鉴定

对小鼠成骨细胞的体外分离培养方法进行了摸索,并对其生物学特性进行了鉴定。手术法分离新生小鼠颅骨骨片,用0．25％胰蛋白酶＋0．02％乙二胺四乙酸（EDTA）预消化20～30min,而后用0．08％胶原酶＋0．05％胰蛋白酶＋0．004％EDTA的复合酶多次消化（每次10min）收集细胞,然后接种于细胞培养瓶中进行培养,并通过苏木精-伊红（HE）染色、BCIP／NBT Kit碱性磷酸酶（ALP）染色、Von Kossa法钙结节染色和四甲基偶氮唑盐（MTT）微量酶反应比色法对培养细胞进行生物学鉴定。结果发现,分离得到的细胞92％为存活细胞,差速贴壁培养后可筛选得到高纯度的成骨细胞,原代培养8d后可形成单层细胞,传代培养6～7d后可形成单层细胞。这些细胞有ALP活性,并具有体外钙化能力。结果表明,本研究建立的小鼠成骨细胞分离培养与鉴定方法是可行的。     

矿化垃圾和绿化植物废弃物在盐碱土上利用的效果

通过矿化垃圾和绿化植物废弃物在盐碱土上的现场应用试验,研究了土壤性质的变化.结果表明,盐碱土上利用矿化垃圾和绿化植物废弃物后pH和盐分降低,土壤肥力提高;但矿化垃圾中有机质相对稳定,而绿化植物废弃物易分解,其土壤微生物量碳、土壤脲酶和土壤磷酸酶增加效果更明显;而且以矿化垃圾、绿化植物废弃物和原土混合后土地利用的效果最好,其次为矿化垃圾和绿化植物废弃物混合,以矿化垃圾和5%原土处理的利用效果最差;而不同废弃物用量中以30%的绿化植物废弃物添加量改良效果最好;不同处理间土壤微生物量碳、土壤脲酶和土壤磷酸酶的变化趋势基本一致,并与有机质存在显著或极显著相关关系,适合评价有机废弃物土地利用的效果.     

小鼠胚胎干细胞体外定向诱导分化成骨细胞

将小鼠5d龄ES-D3细胞源的类胚体(EBs)单细胞,按5×104/mL接种6孔细胞培养板,在DMEM基础培养基中使EBs单细胞贴壁培养。于第14!21天时,分别添加60%成骨细胞条件培养液(A组)、50μg/mL维生素C"50mmol/Lβ-磷酸甘油(B组)和50μg/mL维生素C"50mmol/Lβ-磷酸甘油"1μmol/L地塞米松(C组),并设不添加诱导剂对照组(D组)。第22天时用1%茜素红染色显示阳性细胞,计算成骨细胞诱导形成率,数据用方差分析和多重比较检验。结果表明,A组细胞增殖呈团状聚集,茜素红染色阳性细胞结节多分布于聚集的细胞群内及其边缘,成骨细胞诱导形成率为10.04%,与对照组比较,差异极显著(P<0.01);B组诱导分化的细胞分泌物形成网状结构,茜素红染色阳性细胞分布在这些网状结构中,成骨诱导形成率为7.43%,与对照组比较差异显著(P<0.05);C组茜素红染色阳性细胞分散而均匀,但未出现网状结构,成骨细胞诱导形成率提高至27.57%,与对照组比较差异极显著(P<0.01)。     

根际过程和高底物浓度促进黑土有机磷矿化

土壤有机磷是植物吸收磷素的重要来源之一。大量研究表明,植物根际过程能够促进土壤有机磷矿化,提高土壤有机磷的生物有效性。以高有机质含量的黑土为研究对象,通过温室根垫培养和大田原位测定相结合的方法,旨在揭示玉米和蚕豆根际过程和土壤有机磷浓度对有机磷矿化的影响。结果表明:温室条件下,不施肥(CK)处理的蚕豆根际pH未变化,玉米根际pH上升了0.09个单位;施氮磷钾肥和有机肥(NPKM)处理的蚕豆根际酸性磷酸酶活性较玉米高93.4%;CK处理的玉米、蚕豆根际土与空白土(相同装置下不种作物的土壤)有机磷含量无差异,NPKM处理有机磷在玉米和蚕豆根际分别耗竭了138和86 mg·kg~(-1)。根际有机磷浓度是驱动有机磷矿化的主要因素。田间玉米的根际pH与非根际相比下降了0.3～0.51个单位,酸性磷酸酶活性提高了10倍以上,施肥处理的根际苹果酸分泌量较不施肥处理高357%;根际过程与有机磷浓度可能共同调控了根际有机磷的矿化过程。因此,构建土壤高有机磷库,选择高效利用有机磷的作物品种,是维持黑土供磷能力、实现减磷增效的措施之一。     

乙炔抑制方式对潮土硝化和矿化作用的影响

在土壤最大持水量60%和温度28?C的实验室培养条件下,研究了乙炔的不同抑制方式(短时前期暴露/连续灌注法)对潮土硝化、矿化作用的影响。结果显示,连续14天灌注10 ml/L或100 ml/L浓度乙炔完全抑制了供试潮土的硝化作用,而将土样短时前期暴露于乙炔12 h后驱散乙炔,仅能保持48 h的抑制效果,驱散乙炔后第3天土样的硝化作用开始恢复,培养结束时土样的硝化率仍可达到99%。本研究的结果还显示,培养结束时,加入乙炔的4个施N处理其净矿化量为负值,乙炔连续抑制方式下土样净矿化量低于乙炔短时前期暴露方式下土壤的净矿化量。因此,采用乙炔抑制技术进行研究时应当考察所采集的供试土壤在乙炔抑制方式下的硝化活性恢复速率和矿化过程,以保证相关试验方法设计的合理性。对培养期较长的试验,采用连续灌注乙炔,并将通风时间控制在硝化活性恢复点以前的方式是区分硝化类型较为适用的实验室方法。     

过表达miR-128a抑制大鼠前体脂肪细胞分化

为阐明miR-128a在大鼠前体脂肪细胞分化过程中的功能,本实验检测了大鼠(Rattus norvegicus)前体脂肪细胞成脂分化过程中miR-128a的表达,明确其在分化过程中的表达趋势;构建miR-128a的腺病毒过表达载体并侵染大鼠前体脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测了成脂标记基因过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2,aP2)的表达;过表达miR-128a的大鼠前体脂肪细胞在第10天进行油红O染色,从形态学上观察成脂分化情况.结果显示,miR-128a的表达量在脂肪细胞诱导分化第二天降到最低点,随后维持在第0天的水平.在过表达miR-128a后,大鼠前体脂肪细胞成脂标记基因PPARγ和aP2的蛋白表达量与对照相比显著下降,脂滴明显少于对照组.实验结果表明:在大鼠前体脂肪细胞中过表达miR-128a能够抑制前体脂肪细胞的分化;并且通过PPARγ mRNA和蛋白水平的差异性变化,结合miRNA的作用机理,推测PPARγ有可能是miR-128a的靶基因.本实验也为研究miR-128a在脂肪细胞分化中发挥作用的机理提供了理论基础.     

超表达线粒体融合蛋白2基因(Mfn2)抑制小鼠卵母细胞体外成熟

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2,Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控,在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用.本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响.从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体.经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞),确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位.将pMfn2-Venus体外转录为cRNA,并注射入小鼠卵细胞中,进行体外成熟培养,并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody,PB1)排出率,荧光显微镜下观察其表达及定位.结果显示,注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞,其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001,P＜0.05).本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响,为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向,同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台.     

豇豆胰蛋白酶抑制剂和硫氧还蛋白的融合表达和活性测定

采用融合蛋白表达技术，通过1个人工设计合成的柔性接头，将豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)基因与表达载体上的硫氧还蛋白(thioredoxin )基因连接，构建了融合表达载体。将表达载体转入大肠杆菌(Escherichia coli )GI724，通过色氨酸诱导获得高效表达，产物以可溶状态存在。活性测定显示，融合蛋白具有抑制胰蛋白酶的生物学活性。以大豆胰蛋白酶抑制剂为参照，将融合蛋白热处理后进行活性测定，发现它具有较好的热稳定性。将肠激酶(enterokinase)与融合蛋白在37 ℃作用16 h，可获得切掉thioredoxin的CpTI蛋白。活性测定显示，切除thioredoxin后CpTI的胰蛋白酶抑制活性比同样处理条件下的thioredoxin-CpTI明显下降，比活力仅为原来的80%，说明融合蛋白具有更高的稳定性。研究结果为thioredoxin-CpTI作为一种生物农药的应用奠定了基础。     

反义抑制水稻蔗糖转运蛋白基因(OsSUT5)的表达降低其愈伤组织诱导和植株再生频率

蔗糖转运蛋白(sugar transporters,SUT)是一类介导蔗糖跨膜运输的蛋白,在植物的生长发育过程中起重要作用。水稻(Oryza sativa L.)SUT家族中有5个蔗糖转运蛋白,其中OsSUT3、OsSUT4和OsSUT5的大部分功能还未揭晓。本研究以转反义OsSUT5基因水稻为实验材料,通过抑制OsSUT5基因的表达,比较愈伤组织增殖率和植株分化率,分析反义抑制OsSUT5基因表达对愈伤组织诱导和分化能力的影响。结果显示,反义抑制OsSUT5的水稻,盾片膨大以及愈伤组织的诱导和增殖率显著下降(P0.05),第1代愈伤组织干重为0.028 80 g/皿,第2代为0.119 93 g/皿,显著低于野生型水稻的0.058 70 g/皿和0.174 55 g/皿(P0.05);继代培养5代之后,转基因和野生型的水稻愈伤组织鲜重增加没有显著差异,但转基因水稻的愈伤组织活力下降、水渍状明显,绿苗分化率为65%,显著低于野生型水稻的82.5%(P0.05);对愈伤组织的OsSUTs基因定量分析显示,与野生型水稻相比,转基因水稻的OsSUT5和OsSUT1基因表达量下降近1倍,而OsSUT2和OsSUT4基因表达差异不显著(P0.05)。研究结果提示,OsSUT5基因参与水稻组织培养过程中外植体对蔗糖的吸收和转运,为深入解析OsSUT5基因的功能提供参考资料。     

miR-196a-1在3T3-L1脂肪细胞分化中的表达及作用

为研究miR-196a-1在脂肪形成中的作用,从3T3-L1细胞基因组中扩增miR-196a-1前体序列,构建miR-196a-1的表达载体,获得稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株,成脂诱导后检测脂肪细胞分化关键转录因子的mRNA表达和脂滴累积情况。结果表明,miR-196a-1在3T3-L1细胞分化过程中表达上调,在诱导分化的第2天达到高峰,并在之后的分化过程中恢复到正常水平;稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株中miR-196a-1的持续高水平表达导致脂肪形成关键基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂蛋白脂酶(LPL)的mRNA水平及脂滴累积明显增加。这些结果指明,miR-196a-1促进3T3-L1脂肪细胞分化,利用所构建的稳定表达miR-196a-1的细胞株可进一步研究miR-196a-1调节脂肪形成的分子机制。     

华恢1号衍生系旱恢3T的选育及抗虫表现

水稻作为世界上主要的粮食作物之一,容易受到螟虫、稻飞虱、稻象甲等主要害虫为害造成减产.为改良节水抗旱稻的抗虫性,以华恢1号(TT51)为cry1Ab/Ac基因供体,与节水抗旱稻恢复系品种旱恢3号杂交,利用分子标记辅助选择技术对目标基因进行筛选,最终获得BC3F4纯合、稳定株系.通过对Cry1Ab/Ac蛋白的定性和定量检...     

大鼠肌肉卫星细胞的分离、鉴定与诱导分化

肌肉卫星细胞是组织特异性干细胞,负责着骨骼肌的生长和再生.尽管发现卫星细胞的存在已经有50多年的历史了,但分离鉴定肌肉卫星细胞的方法仍然不稳定.本研究使用两步酶消化和差速贴壁相结合的方法分离大鼠(Rattus norve gicus)肌肉卫星细胞.免疫细胞化学染色显示,分离的大鼠肌肉卫星细胞高表达Desmin;通过RT-PCR鉴定所分离的细胞表达肌源性干细胞因子Myf5及Myod1;成肌诱导48h后,卫星细胞开始形成多核的肌管;成脂诱导1周后,细胞内开始出现脂滴,2周后充脂细胞明显增多.研究结果提示,分离的卫星细胞具有肌源性,有发育形成肌管和向成脂细胞分化的能力.     

Intracellular mediators of procyanidin-induced lipolysis in 3T3-L1 adipocytes

We have previously reported that grape seed procyanidins stimulate long-term lipolysis on 3T3-L1 fully differentiated adipocytes. To unravel the molecular mechanism by which procyanidins exert this effect, we checked the involvement of two main cellular targets in adipose cells: protein kinase A (PKA) and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-gamma). Procyanidin treatment increased intracellular cAMP levels in 3T3-L1 adipocytes, and their lipolytic effect was inhibited by simultaneous treatment with H89, a PKA specific inhibitor. BRL49653, a very highly specific ligand of PPAR-gamma, totally abolished the lipolytic effect of procyanidins. Simultaneous to this long-term lipolytic effect, the mRNA levels of some differentiation adipocyte markers decreased, although there were no changes in the triglyceride content of the cells. BRL49653 did not antagonize the decrements of differentiation markers. These results support a mediation of PPAR-gamma and PKA on the lipolytic effects of procyanidins on 3T3-L1 adipocytes.     

广西德保猪MC1R基因的克隆与分析

近年来含有天然黑色素的动植物黑色食品得到青睐,为探讨广西地方品种德保猪全黑毛色形成的分子机制,本文克隆了广西德保猪MC1R基因并进行了系统生物信息学分析。根据NCBI已公布的猪MC1R基因序列（GI：347618788）设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆获得长1 519 bp的MC1R基因序列片段。多重序列比较结果显示克隆片段与已公布的猪、牛、人、狗、绵羊、小鼠和鸡的相似性依次分别为99%、87%、86%、85%、84%、81%和77%,表明MC1R基因在不同哺乳动物间具有较高的保守型。德保猪MC1R蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量为34.65 ku,等电点为8.70,为弱碱性蛋白,N-末端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有1个低复杂度结构域和7个跨膜结构域,具有典型的细胞膜受体蛋白结构。多项研究报道表明MC1R基因是动物毛皮颜色重要的决定基因,德保猪MC1R基因克隆为揭示其全黑色形成的分子机制奠定了较好的实验基础。     

PPI1在裸鼠体内抑制人宫颈癌细胞HeLa生长的研究

探讨PPI1基因在裸鼠体内对人宫颈癌细胞生长的抑制作用。首先将稳定表达PPI1野生型和突变活化型基因的人宫颈癌细胞HeLa进行裸鼠体内致瘤,观察PPI1对肿瘤生长的影响;其次构建野生型HeLa细胞宫颈癌裸鼠模型,通过在体电脉冲技术,将PPI1野生型和突变活化型基因导入瘤体内进行基因治疗,观察裸鼠的存活情况;FACS分析移植瘤的细胞周期分布;免疫组化法检测移植瘤中的PPI1、cyclin B1、p53和p21的表达水平。在致瘤实验中,稳定表达PPI1突变活化型基因的HeLa细胞组的瘤结节生长缓慢,瘤结节明显小于对照组;在基因治疗实验中,PPI1突变活化型基因治疗组的裸鼠生存期明显延长,瘤组织中的肿瘤细胞呈现G2/M期停滞,cyclin B1和p21的表达水平明显增强,而突变型p53的表达明显减弱。PPI1活化型突变体对裸鼠HeLa移植瘤生长有明显的抑制作用。     

联合基因Survivin、CDK1的shRNAs靶向干扰对鼻咽癌CNE-2细胞增值的影响

为了构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体,并研究其靶向干扰对鼻咽癌细胞CNE-2生物学行为的改变。本研究通过构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体,用脂质体Lipofectamine 2000法将其转染入CNE-2细胞株中,应用RT-PCR方法初步筛选具有干扰效应的重组载体,逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测Survivin、CDK1 mRNA的基因表达水平,Western blot检测Survivin和CDK1蛋白表达以及噻唑蓝溴化四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测癌细胞增殖活性的变化。结果表明：成功构建具有干扰效应的shRNAs表达载体;联合或单基因Survivin、CDK1的shRNAs表达载体干扰CNE-2细胞后,其对应的mRNA和目的蛋白表达均降低,CNE-2癌细胞增殖活性降低,联合基因shRNAs表达载体具有一定程度的干扰增强作用。     

山羊乳腺上皮细胞的培养及EGFP基因转化

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物，并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构，呈乳头状，称之为乳球体；乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型，大多数上皮细胞呈短梭形或多角形，呈蜂窝状；部分细胞呈圆饼状，体积较大；部分细胞呈长形。采用电穿孔法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞，荧光显微镜下观察到EGFP基因的表达。     

Effects of capsaicin on induction of apoptosis and inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells

Currently, at the beginning of the 21st century, obesity has become the leading metabolic disease in the world. It is a serious health problem in industrialized countries. Previous research has suggested that decreased preadipocyte differentiation and proliferation and decreased lipogenesis are mechanisms to reduce obesity. In the present study, the effects of capsaicin on the induction of apoptosis and inhibition of lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes and adipocytes were investigated. The results demonstrated that capsaicin decreased cell population growth of 3T3-L1 preadipocytes, assessed with the MTT assay. Flow cytometric analysis of 3T3-L1 preadipocytes exposed to capsaicin showed that apoptotic cells increased in a time- and dose-dependent manner. Treatment with capsaicin decreased the number of normal cells and increased the number of early apoptotic and late apoptotic cells in a dose-dependent manner. The treatment of cells with capsaicin caused the loss of mitochondria membrane potential (delta psi m). The induction of apoptosis in 3T3-L1 preadipocytes by capsaicin was mediated through the activation of caspase-3, Bax, and Bak, and then through the cleavage of PARP and the down-regulation of Bcl-2. Moreover, capsaicin significantly decreased the amount of intracellular triglycerides and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity in 3T3-L1 adipocytes. Capsaicin also inhibited the expression of PPARgamma, C/EBPalpha, and leptin, but induced up-regulation of adiponectin at the protein level. These results demonstrate that capsaicin efficiently induces apoptosis and inhibits adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes and adipocytes.